阿霉素丙二醇脂質體的制備及體外抗腫瘤作用研究

化療作為癌癥治療的主要手段，存在兩大問題：一是化療藥物缺乏選擇性，二是多藥耐藥性[1-2]。靶向藥物制劑成為當今抗腫瘤領域的研究主流[3-4]。高通透性和高滯留性[高滲透長滯留效應（EPR效應）]是腫瘤靶向藥物設計的金標準[5]。醇質體是一種新型的柔性脂質體，是在脂質體的雙分子層中加入不同的柔軟劑，使脂質體膜具有較強的柔順性和變形性，具有滲透性強的特點[6-7]。以丙二醇替代乙醇作為柔軟劑，既保持了醇質體“可塑、柔韌、高滲透性”的優點，又克服了易揮發的缺點，從而使藥物能夠利用EPR效應被動靶向聚集在腫瘤間質[8-9]。泊洛沙姆是聚氧乙烯（PEO）-聚氧丙烯（PPO）-聚氧乙烯（PEO）的三嵌段共聚物。其中，PEO嵌段具有親水性，而PPO嵌段具有疏水性，可根據聚合物分子中PEO和PPO的比例區別不同型號的泊洛沙姆。Ⅱ類泊洛沙姆能夠最大程度地降低細胞膜微觀黏度和耗竭細胞內腺苷三磷酸（ATP），抑制P-糖蛋白（P-gp）對阿霉素、紫杉醇等藥物的外排[10-13]。

本研究將泊洛沙姆逆轉腫瘤多藥耐藥的聚合物療法與納米級載藥丙二醇脂質體技術相結合，制備多功能阿霉素丙二醇脂質體（A-PL），提高腫瘤組織對化療藥物的吸收并降低其產生耐藥性，以期探索出一種提高腫瘤化療效率和安全性的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

透射電鏡（JEM-2100F，日本電子株式會社）、激光粒度分析儀（Mastersizer 2000，英國馬爾文儀器有限公司）、倒置熒光顯微鏡（Nikon eclipse TS100，日本Nikon）、全自動酶標儀（SpectraMax M2/M2e，美國Bio-Rad公司）、CO2恒溫細胞培養箱（M2300，美國Sheldon公司）、Zeta電位測定儀（馬爾文，北京東方安諾生化科技有限公司）。

1.2 試藥

人肝癌細胞HepG-2細胞由溫州醫科大學藥學院提供。6孔、96孔細胞培養板（美國Costar原裝）、大豆卵磷脂E200（批號：139060，上海艾韋特醫藥科技有限公司）、泊洛沙姆188（批號：WPAK524B，BASF公司）、膽固醇（批號：CC25151602，上海艾韋特醫藥科技有限公司）、吐溫-80（批號：50116，天津市光復精細化工研究所）、鹽酸阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司）、磷酸緩沖鹽溶液（PBS，批號：AC10260338，Hyclone）、MTT試劑盒（批號：01191818 0508，上海碧云天生物技術有限公司）、胎牛血清（批號：1428478，Gibco公司）、RPM1640培養液（批號：8115111，GIBCO公司）、0.25%胰蛋白酶消化液（批號：1869505，GIBCO公司）、二甲基亞砜（批號：1213C025，Solarbio公司）、1，2-丙二醇（批號：74697305，上海邁瑞爾化學技術有限公司）、檸檬酸鈉（批號：F20110114，上海滬試實驗室器材股份有限公司）、無水海藻糖（20160711，上海沃凱生物技術有限公司）、羅丹明123（Rh123）試劑（批號：R8004，sigma公司）。

2 方法與結果

2.1 方法

2.1.1 阿霉素丙二醇脂質體的制備  精密稱取阿霉素（ADR）24 mg、大豆卵磷脂 40 mg、膽固醇20 mg、吐溫-80 2 mg、檸檬酸鈉5 mg、泊洛沙姆188 20 mg加入到2 mL丙二醇（丙二醇∶5%海藻糖=1∶5）中，60℃水浴溶解。將溶解后的丙二醇溶液緩慢加入到10 mL含有5%海藻糖溶液中，750 r/min旋轉30 min，再分別經0.8、0.65、0.45、0.3、0.22 μm微孔濾膜過濾，即得A-PL，濃度為2 mg/mL[14]。

2.1.2 粒徑與Zata電位檢測  取制備好的A-PL溶液，純水稀釋10倍后用激光粒度分析儀和Zeta電位分析儀分別測定脂質體粒徑大小和Zeta電位。

2.1.3 包封率和載藥量檢測  采用超速離心法分離未包封的游離藥物，HPLC高效液相法檢測藥物含量。色譜條件為：色譜柱KrusamA-PL C18（4.5 nm×250 nm，5 μm），保護柱：Agilent XDB-C18（4.5 mm×12.5 mm，5 μm），流動相為甲醇-1%冰醋酸（30∶70），柱溫室溫，UV檢測吸收波長為230 nm，流速為l mL/min。計算公式為：包封率=（藥物投料量-游離的藥物量）/藥物投料量×100%;載藥量=脂質體中藥物量/（脂質體中藥物+載體總量）×100%

2.1.4 細胞毒性檢測  將HepG-2細胞種植在96孔板上（5×103個/孔）。孵育24 h后，每孔板分別加入空白乙醇脂質體和空白丙二醇脂質體，比較不同載體濃度對細胞存活率的影響。再取24孔板，分別加入不同濃度的A-PL和ADR溶液，并設立對照組（空白對照與陰性對照）。每組設5個濃度，分別為1、5、10、50、100 μg/mL。孵育12 h后，移去藥液并加入新鮮培養基及MTT溶液10 μL（5 mg/mL），培養4 h，加入100 μL二甲基亞砜，振搖均勻，酶聯免疫法測定570 nm處的吸光度并計算細胞存活率。

2.1.5 HepG-2對A-PL的攝取檢測  將HepG-2細胞種接種在6孔板上，過夜。每孔板分別加入5個濃度的A-PL和ADR溶液，分別為1、5、10、50、100 μg/mL。孵育15 min后制備細胞懸液（0.5 mL/管）于流式管中檢測。

2.1.6 HepG-2對阿霉素丙二醇脂質體的促攝取機制  將HepG-2細胞種植在6孔板上過夜。每孔板加入50 μg/mL A-PL，分別孵育2、6、12、24 h后移去藥液并用冰PBS沖洗干凈，于倒置熒光顯微鏡觀察。

2.1.7 P-gp功能檢測  選用環保菌素A（CsA）為陽性對照藥物，其主要作用機制為抑制P-gp功能。將HepG-2細胞接種于6孔板過夜，密度為1×106個/mL。實驗分組設計：組1（陰性對照組）：Rh123;組2：Rh123+ADR;組3：Rh123+A-PL;組4（陽性對照組）：Rh123+CsA。

2.1.8 統計學方法  采用SAS 8.01統計學軟件對數據進行分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，組間比較用Newman-Keuls檢驗，組內比較用Student′s t-test，以P < 0.05為差異有統計學意義。

2.2 結果

2.2.1 阿霉素丙二醇脂質體表征  A-PL微觀形態結構圓整，且具有明顯的磷脂雙分子層，部分醇脂體形成多層脂質體結構，粒徑在150 nm左右（圖1）。圖2所示測得的粒徑為164 nm，多分散指數（PDI）為0.145，粒徑對稱分布，單分散性較好，略大于透射電鏡結果，符合預期。Zata電位為-5.78 mV，粒徑對稱分布，彈性值>40。結果表明制備的A-PL形態好，粒徑小，具有良好的柔韌性和可塑性。

2.2.2 包封率和載藥量  評價脂質體物理性質的重要指標包括包封率和載藥量。20 000 r/min離心15 min后檢測制備的A-PL包封率為83.7%，符合2015版《中華人民共和國藥典》規定。

2.2.3 細胞毒性  細胞毒性大小影響著細胞生理活動，脂質體是造成細胞毒性的根本原因[15-16]。當載體濃度<25%，細胞存活率均>90%，而細胞存活率隨乙醇脂質體的載體濃度的增加而顯著下降;當載體濃度>25%，丙二醇脂質體組細胞存活率顯著降低，乙醇脂質體組細胞存活率<10%（圖3）。提示丙二醇脂質體較傳統的乙醇脂質體具有更好的細胞安全性。載體濃度均<25%，可不考慮空白丙二醇脂質體對細胞的影響。

本研究還比較了A-PL與ADR溶液對細胞存活率的影響。隨ADR濃度增加，HepG-2細胞存活率與藥物劑量存在相關性;在同等濃度下，A-PL的細胞抑制率較高（圖4）。提示本研究制備的A-PL由于其特殊優勢保持并提高了ADR的抗腫瘤活性。

2.2.4 阿霉素丙二醇脂質體促細胞藥物攝取  細胞內藥物攝取呈劑量依賴性;隨著濃度增大，A-PL組與溶液組均向右位移;但無論在低濃度還是高濃度條件下，A-PL組的位移距離大于溶液組（圖5）。提示丙二醇脂質體可增強HepG-2細胞對ADR的攝取，有利于藥物富集于靶細胞，并且發揮藥效。

隨著A-PL作用時間延長，細胞形態隨之發生改變。作用2 h時HepG-2形態基本保持梭形;24 h后，細胞數量稀少，形態變圓形，并且可以看到細胞核中的熒光強度更大，提示A-PL具有良好的細胞毒性，粒徑小，制劑中加入的丙二醇增強了滲透性，使其與細胞核更具親和性。見圖6（封四）。

2.2.5 P-gp功能檢測  細胞內的Rh123累積量與劑量相關。與陰性對照組（組1）比較，ADR濃度<5 μg/mL時，ADR溶液處理（組2）的細胞內Rh123累積量無明顯變化;A-PL處理（組3）的細胞內Rh123累積量顯著較高（P < 0.05）。與陽性對照組（組4）比較，當ADR濃度>50 μg/mL時，ADR處理（組2）和A-PL處理（組3）的細胞內Rh123累積量差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖7。這說明A-PL克服腫瘤耐藥性并不只是依賴內吞作用，其還能抑制P-gp對ADR的外排。

3 討論

本研究基于已有丙二醇脂質體制備方法基礎上，繼續優化處方工藝，用丙二醇代替傳統的乙醇等溶劑，并加入一定濃度泊洛沙姆，制備出新型的A-PL。外源性物質除通過細胞膜上的微型孔道或者自由擴散的方式進入細胞漿外，還可以通過內吞進入[17-18]。丙二醇是一種良好的促滲劑，能增加脂質體的彈性，使細胞脂質膜由膠晶態轉變為液晶態，增加細胞膜的流動性和細胞表面的孔道，有利于脂質體進入細胞[19]。熒光顯微鏡下觀察藥物攝取結果提示，ADR溶液主要以擴散的方式進入細胞，而本研究制備的A-PL則主要以內吞方式進入細胞核。

本研究結果表明，基于丙二醇特性，使得A-PL更易進入細胞，且與細胞有較強的親核性。泊洛沙姆逆轉腫瘤多藥耐藥性的機制為：游離的PPO嵌段會插入生物膜的脂溶性區域，擾亂了生物膜的結構，進而改變其流動性[20-21]。同時，本研究結果顯示含泊洛沙姆的脂質體可以顯著抑制P-gp對ADR的外排。

綜上所述，A-PL不僅可以降低阿霉素的本身毒性，還可減少藥物用量，克服腫瘤耐藥性，提高抗腫瘤效果。其作用機制主要包括：①由于其具有高滲透性和滯留性，即高EPR效應，其通過內吞進入細胞，具有較強的親核性。②通過抑制P-gp過表達而起到克服腫瘤耐藥性的作用。下一步研究中，我們將考察A-PL體內藥動學特征及在組織中的分布特點，為進一步研究丙二醇脂質體作為藥物載體體內給藥奠定研究基礎。