限制性內切酶已有百余種，每種酶有其特定的核苷酸序列識別特異性，酶的活性需Mg2+來激活。不同的酶也有許多差別：有些酶除需Mg2+外，還需ATP等其他輔助因子的激活；切割位點和識別序列間的距離不同；某些內切酶同時具有甲基化作用。根據這些差別，可將限制性內切酶分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅱ型限制性內切酶只需要Mg2+來激活，酶在其識別序列內切割雙鏈DNA，產生的各種DNA片段具有相同的末端結構，而且大多數的Ⅱ型酶可提供粘性未端，有利于片段再連接，大部分Ⅱ型酶所識別的序列具有反向對稱結構（回文結構）。
限制性內切酶對環狀質粒DNA產生的酶切片段數與切口數一致，因而酶切后的片段在電泳凝膠中的區帶數，就是切口的數目。用DNA Marker作為對照，通過電泳遷移率的比較，可以粗略地測出分子形狀相同的未知DNA的相對分子大小。