限制性核酸內切酶（restrictionendonuclease），又簡稱限制酶或內切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。它們的發現和應用為從基因組中分離目的基因提供了必要的手段.限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。
限制酶主要來源于原核生物，是一組能水解DNA磷酸二酯鍵的酶。迄今已發現的限制酶多達數百種，分為三類。在基因工程中使用的主要是第二類。限制酶根據其來源命名。
