限制酶的上述特性在基因工程和基因診斷中具有重要用途：
①首先不論DNA的來源如何，用同一種內切酶切割后產生的粘性末端很容易重新連接，因此很容易將人和細菌或人和質粒任何兩個DNA片段連接在一起，即重新組合，這是重組DNA技術的基礎。
②人類的基因組很大，不切割無法分析其中的基因。限制酶能把基因組在特異的部位切開，即切割不是隨機的，因而從每個細胞的基因組得到的是相同的一組長度各異的片段。這些可能含有某一基因的片段可用電泳分離，并加以研究。
③由于限制酶的特異性，如果識別位點的堿基發生了改變，限制酶將不再能切割；同樣，堿基的改變也可能導致出現新的酸切位點。
在人類基因組中，這兩種情況是十分常見的，而切點的消失或出現將影響獲得的DNA片段的長度，表現為限制性片段長度多態性（RFLP），這在基因的連鎖診斷中具有極重要的意義。