限制酶是識別特定的核苷酸序列，并在每條鏈中特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵進行切割的一類酶。
根據酶的功能特性、大小及反應時所需的輔助因子，限制性內切酶可分為兩大類，即I類酶和Ⅱ酶。最早從大腸桿菌中發現的EcoK、EcoB就屬于I類酶。
其分子量較大；反應過程中除需Mg2+外，還需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP；在DNA分子上沒有特異性的酶解片斷，這是I、Ⅱ類酶之間最明顯的差異。
Ⅱ類酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道爾頓；反應只需Mg2+；最重要的是在所識別的特定堿基順序上有特異性的切點，因而DNA分子經過Ⅱ類酶作用后，可產生特異性的酶解片斷，這些片斷可用凝膠電泳法進行分離、鑒別。