| 實驗方法原理 | |
|---|---|
| 實驗材料 | DNA 庫 |
| 試劑、試劑盒 | 氫氧化銨 正丁醇 TE 緩沖液 尿素上樣緩沖液 NaCl 乙醇 |
| 儀器、耗材 | 熒光薄層層析板（VWR） 紫外燈 剃刀刀片 小孔注射器 能耐受極端溫度的 13 ml 離心管（Sarstedt） 90℃水浴 旋轉混合器 |
| 實驗步驟 |
實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」 1. 寡核苷酸合成完畢后，去保護，從固相支持物上切下，然后將溶液凍干（在濃縮的氫氧化銨中），或者用 10 倍體積的正丁醇于 -70℃ 放置＞1h 將寡核苷酸沉淀出來。 2. 制備一塊變性的聚丙烯酰胺膠。 3. 用 100～200 ul 的水或緩沖液（如 TE 緩沖液，pH 8.0） 重新溶解凍干的或沉淀出的寡核苷酸，加入等體積的 2×上樣染料。上樣前將樣品加熱到 75℃ 熱變性 5 min。 每一 2 cm×2 cm×1.6 mm 的孔中加入約 20％ 的 1 umol 合成的寡核苷酸進行電泳分離。 4. 將膠放到塑料膜包裹的熒光薄層層析板上，在紫外燈的照射下用刀片切下寡核苷酸產物（通常為最暗的陰影條帶）。 5. 按如下步驟將寡核苷酸從膠條中洗脫出來： 5.1 為了幫助寡核苷酸從丙烯酰胺基質中擴散出來，用力讓膠條擠過小孔注射器以使之變為粉碎的顆粒。 5.2 將碎膠放入一個能耐受極端溫度的 13 ml 的離心管中。 5.3 每 0.5 ml 的膠條（一般相當于 1～2 個加樣孔的量）加入 3 ml 的 TE 緩沖液，pH 8.0，將樣品于 -80℃ 放置 30 min 或直到樣品凍成固體。 5.4 將離心管放于熱水浴中迅速解凍樣品，然后于 90℃ 浸泡 5 min。將樣品放于旋轉混合器上于室溫洗脫 DNA 過夜。 6. 用 5mol/L NaCl 儲液將寡核苷酸洗脫液的鹽濃度調整到 0.3 mol/L， 然后加入 3 倍體積的乙醇以沉淀寡核苷酸庫。于 -20℃ 放置 3 h，然后于 4℃ 以最高轉速離心。凍干。用 TE 緩沖液（pH 8.0，防止核酸酶污染或 pH 的劇變）重溶合成的庫。
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| 注意事項 | |
| 其他 |
1. 材料 DNA 庫 2. 試劑 氫氧化銨 正丁醇 TE 緩沖液，pH 8.0 尿素上樣緩沖液，2× 5 mol/L NaCl 乙醇 3. 耗材 熒光薄層層析板（VWR），塑料膜包裹 紫外燈 剃刀刀片 小孔注射器 能耐受極端溫度的 13 ml 離心管（Sarstedt） 90℃ 水浴 旋轉混合器
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