隨機引物法標記DNA

大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段 隨機脫氧核苷酸引物 模板 DNA

醋酸氨 乙醇 NA 終止 貯存緩沖液 隨機引物緩沖液 dNTP 溶液

堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠 沸水浴或加熱板 微量離心管 SephadexG-50 離心柱

一、材料

1. 緩沖液和溶液

醋酸氨（10 mol/L）

乙醇

NA 終止/貯存緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）

5X 隨機引物緩沖液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl₂，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉蘇糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 調至 pH 6.6），1 mol/L DTT 貯存于 -20℃，臨用前用水稀釋，使用后棄去稀釋的 DTT。）

2. 酶和緩沖液

大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段

3. 凝膠

堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠

4. 核酸和寡核苷酸

含三種未標記的 dNTP 溶液（各 5 mmol/L)

長度為六或七個堿基的隨機脫氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6）

模板 DNA ( 5~25 ng/μl TE，pH 7.6）

5. 放射性復合物

[α-³²P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）

6. 專用設備

預熱至 95℃ 的沸水浴或加熱板

微量離心管（0.5 ml )

SephadexG-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡

二、方法

1. 在一個 0.5 ml 的微量離心管中加入溶于 30 μl 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 μl 隨機脫氧核苷酸引物（約 125 ng）。蓋緊微量離心管，置于沸水浴中 2 min。

2. 將微量離心管移至冰上放置 1 min，4℃ 下離心 10s 使引物與模板的混合物沉降至管底，將微量離心管重新置于冰上。

3. 在引物與模板的混合物中加入：

5 mmol/L dNTP 溶液       1 μl

5X 隨機引物緩沖液         10 μl 

10 mCi/ml [α-³²P] dNTP  5 μl

( 比活性 3000 Ci/mmol）

水                                   加至 50 μl

4. 加入 5 單位（約 1 μl）的 Klenow 片段，輕彈管壁以混合各組分。以最大速度離心 1~2s 使所有液體沉降到管底。反應混合物室溫下反應 60 min。

5. 在反應液中加入 10 μl NA 終止/貯存緩沖液，可根據需要進行以下步驟。

貯存放射性標記的探針于 -20℃ 以備雜交用。

或

通過離心柱層析分離放射性標記的探針與未結合的 dNTP 或以乙酸銨和乙醇選擇性地沉淀放射性標記的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反應中摻入，可不進行該步驟。