實驗方法原理 利用寡核苷酸作引物，DNA 聚合酶可沿單鏈模板起始 DNA 的合成（Gotilian 1969)。如果寡核苷酸的序列不均一，它們就可在模板的多位點上與模板雜交。因此模板上每一核苷酸（5' 端的核苷酸除外）的互補物將以同樣的頻率摻入產物。
實驗材料 大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段隨機脫氧核苷酸引物模板 DNA
試劑、試劑盒 醋酸氨乙醇NA 終止 貯存緩沖液隨機引物緩沖液dNTP 溶液
儀器、耗材 堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠沸水浴或加熱板微量離心管SephadexG-50 離心柱
實驗步驟
一、材料
1. 緩沖液和溶液
醋酸氨（10 mol/L）
乙醇
NA 終止/貯存緩沖液（50 mmol/L Tris-Cl (pH 7.5)，50 mmol/L NaCl，5 mmol/L EDTA (pH 8.0)，0.5% (m/V) SDS）
5X 隨機引物緩沖液（250 mmol/L Tris (pH 8.0)，25 mmol/L MgCl2，100 mmol/L NaCl，10 mmol/L 二琉蘇糖醇（DTT)，1 mol/L HEPES ( 用 4 mol/L NaOH 調至 pH 6.6），1 mol/L DTT 貯存于 -20℃，臨用前用水稀釋，使用后棄去稀釋的 DTT。）
2. 酶和緩沖液
大腸桿菌 DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段
3. 凝膠
堿性瓊脂糖凝膠或變性聚丙烯酰胺凝膠
4. 核酸和寡核苷酸
含三種未標記的 dNTP 溶液（各 5 mmol/L)
長度為六或七個堿基的隨機脫氧核苷酸引物（125 ng/μl TE，pH 7.6）
模板 DNA ( 5~25 ng/μl TE，pH 7.6）
5. 放射性復合物
[α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml，比活性 >3000 Ci/mmol）
6. 專用設備
預熱至 95℃ 的沸水浴或加熱板
微量離心管（0.5 ml )
SephadexG-50 離心柱，用 TE ( pH 7.6) 平衡
二、方法
1. 在一個 0.5 ml 的微量離心管中加入溶于 30 μl 水的模板 DNA ( 25 ng ) 及 1 μl 隨機脫氧核苷酸引物（約 125 ng）。蓋緊微量離心管，置于沸水浴中 2 min。
2. 將微量離心管移至冰上放置 1 min，4℃ 下離心 10s 使引物與模板的混合物沉降至管底，將微量離心管重新置于冰上。
3. 在引物與模板的混合物中加入：
5 mmol/L dNTP 溶液 1 μl
5X 隨機引物緩沖液 10 μl
10 mCi/ml [α-32P] dNTP 5 μl
( 比活性 3000 Ci/mmol）
水 加至 50 μl
4. 加入 5 單位（約 1 μl）的 Klenow 片段，輕彈管壁以混合各組分。以最大速度離心 1~2s 使所有液體沉降到管底。反應混合物室溫下反應 60 min。
5. 在反應液中加入 10 μl NA 終止/貯存緩沖液，可根據需要進行以下步驟。
貯存放射性標記的探針于 -20℃ 以備雜交用。
或
通過離心柱層析分離放射性標記的探針與未結合的 dNTP 或以乙酸銨和乙醇選擇性地沉淀放射性標記的 DNA。如果 >50% 的放射 性 dNTP 已在反應中摻入，可不進行該步驟。