1928年的一天，弗萊明在一間簡陋的實驗室里研究導致人體發熱的葡萄球菌。由于蓋子沒有蓋好，樓上一位研究青霉菌的學者的青霉菌飄到了培養細菌用的瓊脂上。弗萊明驚訝地發現，青霉菌附近的葡萄球菌被溶解了。后來他經過多次實驗，發現這個現象可以重復，據此發現了葡萄球菌的克星——青霉素。1929年，弗萊明因這個發現發表了相關的論文，但是他并沒有找到合適的提純方法，并于1934年停止了對青霉素的研究。
1940年，另外兩位科學家弗洛里和錢恩用青霉素重新做了實驗，并證明了將青霉素注入小鼠體內能有效治療多種細菌感染，而小鼠也能夠健康地活下來。這個實驗說明，青霉素既能殺死病菌，又不損害人體細胞。
1941年前后，弗洛里與錢恩一起實現了青霉素的分離與純化（在美國軍方的協助下，弗洛里在飛行員外出執行任務時從各國機場帶回來的泥土中分離出菌種，使青霉素的產量從每立方厘米2單位提高到了40單位），并發現了青霉素對傳染病的療效。但是，青霉素會使個別人發生過敏反應，所以在使用前必須做皮試。