非損傷性掃描離子選擇電極技術及其在高等植物...（二）

1 SIET 原理

1.1物理學及數學基礎

物質在液體環境中有從高濃度到低濃度擴散的趨勢.對于帶電粒子而言，還有從高電化學電勢到低的電化學電勢運動的趨勢.如果，離子電極的移動距離dx在幾十微米以下，生物材料實驗證明，影響帶電粒子運動的電化學電勢的梯度可以忽略不計，那么，該離子的擴散運動速率可以通過Fick
第一擴散定律計算出來^[7] (圖2).

圖2以Ca²⁺濃度梯度和Ca²⁺微電極為例說明SIET的物理學及數學原理

離子選擇性電極由玻璃微電極、Ag/AgCl導線、電解質(100mmol/L CaCl₂)及液態離子交換劑(LIX) 4部分組成.該電極在待測離子濃度梯度中以已知距離dx進行兩點測量，并分別獲得電壓V₁V₂.兩點間的濃度差dc則可以從V₁，V₂及已知的該電極的電壓/濃度校正曲線計算獲得.D是離子/分子特異的擴散常數(單位:cm^-2sec^-1)，將它們代入Fick的第一擴散定律公式： J_o= - D * dc/dx ，可獲得該離子的移動速率(單位：pmol cm^-2sec^-1)，即：每一秒鐘通過一個平方厘米的該離子/分子摩爾數 .

液態離子交換劑是基于大型中性分子載體的一類有機化合物.目前可以購買得到一些常見的LIX.有些研究人員根據自己的需要還自行開發特殊的LIX，其他的種類還在不斷的開發中. 

1.2計算機技術及系統集成

SIET的誕生、發展與完善與計算機技術的不斷進步是密不可分的^[2,8] .盡管計算機需要同時控制三維運動系統、顯微成像系統和信號放大系統3個子系統，但由于離子選擇電極相對較低的時間分辨率要求，使得普通的個人計算機也可以完全勝任.這為SIET的普及和發展提供了很好的基礎. 

1.3 SIET的緩沖溶液

在使用SIET技術過程中，通常要在溶液中加入一些緩沖劑成份，如：MES，Tris或EDTA 等，用以穩定被測離子以便離子選擇電極進行測量^[9-12] .然而，如果離子緩沖劑選擇或者使用不當，被測離子會與緩沖劑相互干擾，破壞被測離子的濃度梯度或者被大幅度壓縮，從而嚴重影響到SIET的應用效果.Kunkel 等通過系統的比較試驗，尋找到了一些最適合SIET
技術的溶液pH 緩沖劑及其使用方法，并以實際生物材料的研究證明通過使用這些方法可以將SIET測知離子流動速率的能力達到最大化^[13].因此，在SIET
實驗設計過程中，不但要考慮到測量溶液中各種成份對被測樣品生物活性的影響，還要充分考慮到緩沖劑成份對被測離子梯度的作用以及對液態離子交換劑（LIX）有無嚴重干擾.

1.4 SIET測量的空間幾何構型

現有的1-2m微米直徑的離子電極，在電極距被測材料2-20
μm及dx在5-30μm的技術條件下，被測材料離子流動的空間幾何分布可以大致分為3類：點、平面及球體.在離子電極距被測材料小于5μm時，通常認為離子以平面方式運動.

值得一提的是，SIET是目前世界上惟一能夠按照研究人員的設定，以手動或編程的方式，從任意角度(相對于被測物體表面)用離子選擇電極對被測樣品進行測量的系統.利用SIET靈活的空間測量方式的經典的例子是對植物花粉管生長過程中，尖端Ca²⁺內流的研究^[13]. Kunkel 等發現花粉管的生長與Ca²⁺內流密切相關，只有在花粉管尖端迅速生長的部位才能檢測到Ca²⁺內流速度.已經伸長成熟的花粉管，幾乎檢測不到Ca²⁺內流速率.人們不但能夠測量出Ca²⁺的內流速率，而且還計算出該花粉管尖端一個圓盤式的結構是Ca²⁺進入細胞的區域(Cardenas等 1999).

2 SIET 的應用

SIET誕生和發展是在植物學研究中實現的.這可能與植物細胞外的細胞壁對膜片鉗技術來講操作較為困難有關.而利用SIET特有的非損傷性特點，可以在不對細胞、組織甚至器官造成任何損傷的情況下測知離子分子的轉運情況.正是意識到SIET的這一優勢， Kochian 等在原有的Ca²⁺選擇微電極的基礎上，又相繼開發出了H⁺，K⁺，Al³⁺和Cd²⁺離子選擇性電極，將其應用于玉米根和植物毒理學的研究，并為這些電極在動物研究中的應用開辟了道路^[15-17].隨后，SIET技術被應用于整體根、根毛及花粉管的研究，并闡明了諸如鈣離子轉運與樣品內部活動及生長的相關性^[14，18-24].Messerli等應用SIET技術將脈動式的花粉管生長所體現的周期與離子流動速率表現出的頻率相互聯系起來. ^[25]

2.1離子與分子流動的同時測量證明了花粉管堿化帶的存在

Hepler等發現不斷生長的百合花粉管前端存在有一個堿化帶，之后他們提出該堿化帶可能是由于區域的線粒體的密集存在所致^[23].許越等應用SIET特有的雙電極同時測量功能，發現H⁺離子的外流和O₂分子的內流是引起該堿化區的主要原因.花粉管的生長需要大量的能量，能量來源于線粒體的氧化磷酸化. O₂分子的內流，伴隨H⁺離子的外流是形成能量的主要驅動力.也正是由于H⁺離子的外流造成了花粉管前端局部的堿化帶，從而證明Hepler等的假說是正確的(圖3)