[原理]
DNA是通過異羥基洋地黃毒苷（digoxigenin，Dig）配基標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸（dUTP）隨機插入結合而被標記。dUTP通過間臂連結類固醇半抗原異羥基洋地黃毒苷酸基，形成Dig-dUTP，雜交反應后，雜交的靶DNA通過酶聯免疫法與一個抗體復合物[抗異羥基洋地黃毒苷配基堿性磷酸酶復合物（Dig）Ap]結合，接著在5-溴-4氯-3-吲哚磷酸鹽（X-磷酸鹽）和硝基四氮唑藍（NBT）存在下，由酶催化反應，在雜交部位形成藍紫色帶或顆粒。
［操作］
1．轉移
通過打點吸漬、噬菌斑或Sonthern印跡轉移等方法，把被測的DNA轉移到硝酸纖維膜或尼龍膜上。
2．標記探針
取微型離心管于冰上，依次加入：lμg新鮮變性的DNA；2μl六聚核苷酸混合物；2μl dNTP標記用混合物；加無菌雙蒸水至 19μL；加 lμl
DNA聚合酶大片段。37℃保溫 1小時至20小時，加入 2μl EDTA（0.2 mol/L），終止反應，加 2μL 4mol/L
LiCl，75μl預冷的乙醇沉淀DNA，- 70℃ 30分鐘或-20℃ 2小時、離心收集沉淀物，真空干燥后加 50μl TE溶解。
3．預雜交
膜放入袋內 68℃預雜交 1小時，每 100cm2膜至少用 20ml預雜交溶液。
4．雜交
每100cm2膜用2.5 ml雜交液（雜交溶液用預雜交溶液中加新鮮變性的探針組成），68℃至少雜交6小時。
5．洗膜
室溫下用50ml 2×SSC， 0.1％（W/V）SDS洗膜，5分鐘× 2次，68℃用0.1×SSC， 0.1％（W/V）SDS洗膜，15分鐘×2次，晾干。
6．檢測
（1）膜在緩沖液中洗滌1分鐘。
（2）緩沖液Ⅰ稀釋抗體結合物至150 mU/ml（l:5000），稀釋后的抗體結合物在4℃只能穩定12小時。
（3）膜在20ml稀釋的抗體結合物溶液中保溫30分鐘。
（4）用緩沖液Ⅰ洗膜15分鐘×2次。
（5）在緩沖液Ⅱ中平衡2分鐘。
（6）在黑暗條件下，膜與新鮮配制的顯色溶液放塑料袋內密封或放入合適的盒子內，幾分鐘開始顯色。
（7）用50ml緩沖液IV洗膜5分鐘，終止反應。
（8）攝影記錄結果。
試劑與器材]
1．試劑
DNA稀釋緩沖液：Tris.Cl(10mmol/L)，EDTA(lmmol/L)pH 8.0，內含魚精 DNA 50μg/ml。
10×六聚核苷酸反應混合物。
dNTP標記用混合底物：lmmol/L dATP: 1mmol/L dCTP；lmmol/L dGTP；0.65 mmol/L dTTP；0.35mmol/L DigdUTP，pH6.5（20℃）。
DNA聚合酶 I大片段（標記級）：2 U/μl。
(Dig)Ap結合物：多克隆抗異羥基洋地黃毒苷配基Fab片段，結合有堿性磷酸酶750 U/ml。
NBT：濃度為 75mg/ml，溶于 70％（V/V）二甲基甲酰胺硝基四氮唑藍鹽溶液。
X-磷酸鹽：50mg/ml，溶于二甲基甲酰胺的5-溴-4氯-3-吲哚磷酸鹽。
封阻試劑：粉劑
0.2 mol/L EDTA，pH 8.0（20℃）
4mol/L LiCl
70％乙醇
10％（V/V）N-十二烷基肌氨酸鈉鹽.
10％ SDS
20 × SSC
雜交溶液：5×SSC；0.l％（W/V）封阻試劑；0.02％（W/V）SDS。 緩沖液Ⅰ：100 mmol/L Tris-CI；150mmol/L NaCl，PH7.5（20℃）。
緩沖液Ⅱ：0.5 %（W/V）封阻試劑溶于緩沖液中，封阻試劑不會快速溶解，因此應提前1小時配制此溶液，將試劑溶于50～70℃，此溶液保持混濁。
緩沖液Ⅲ：100 mmol/L Tris Cl；100mmol/L NaCl；50mmol/L NaCl；50mmol/L MgCl2，pH9.5(20℃)。
緩沖液IV：10mmol/L Tris Cl；1 mmol/L EDTA，pH 8.0(20℃)。
顯色溶液（新鮮配制）：10ml緩沖液Ⅲ中，加 45μl NBT溶液和 35μl X-磷酸鹽溶液。
2. 器材
常規實驗室儀器設備