鑒定蛋白質中磷酸化的氨基酸殘基是很有意義的。磷酸化作用發生在蛋白質的絲氨酸、蘇氨酸和酩氨酸時，通過部分的HCl水解及接著進行雙向薄層電泳，可以便利地鑒定 標記的磷酸氨基酸。
| 實驗材料 | 蛋白質樣品 |
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| 試劑、試劑盒 | 釩酸鈉封阻液TNTNATris·Cl疊氮鈉印度墨汁染色液TBS |
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| 儀器、耗材 | 吸水紙水浴鍋 |
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| 實驗步驟 | 1. 用等體積的2×SDS上樣緩沖液溶解培養細胞，組織或裂解物，煮沸5 min。 2. 在SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳樣品，用含100 μmol/l 釩酸鈉的轉移緩沖液將蛋白質轉移至適用于免疫印跡分析的膜上。
3. 膜在室溫下用30~50 ml 封阻液封閉30 min 以上。
4. 在帶蓋的塑料容器內，膜與30~50 ml 抗磷酸酪氨酸抗體溶液室溫溫育60~120 min，間或搖動。 5. 取出膜，用吸水紙吸干多余液體，在一個新的塑料容器內，用TBSA溶液洗膜 2次，每次10 min；50 ml NP-40洗膜液洗膜2次，每次10 min；再用50 ml TBSA洗膜2次，每次5 min，棄洗液。 6. 用30~50 ml 含0.5 μCi/ml 125I 標記蛋白A與膜在室溫下溫育60 min，間或搖動。
7. 移出膜，用吸水紙吸干多余液體，同步驟5洗膜。 8. 如果需要，用30~50 ml 墨汁染色液染膜5~10 min，直到有可見蛋白帶，充分洗膜除掉多余的墨計。 9. 用吸水紙吸干多余液體，用塑料包裝膜包好，加上放射性或熒光的位置標記后，用經預閃光致敏的X光片和增感屏，自顯影18 h至10天。 展開 |
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