中國科學院動物研究所王皓毅團隊在Frontiers of Medicine 發表封面文章《利用CRISPR/Cas9在CAR-T細胞中敲除免疫檢查點LAG-3》(標題原文：CRISPR-Cas9 mediated LAG-3 disruption in CAR-T cells)，聚焦靶向基因編輯技術及腫瘤免疫治療研究。為了更好地幫助讀者了解這一前沿領域，Frontiers of Medicine 編輯部特別邀請文章第一作者張永平撰文介紹相關研究背景和潛力。
近年來，嵌合抗原受體T細胞（CAR-T）在腫瘤免疫治療領域發展迅速，2013年被Science雜志評為生物醫學領域“十大科技突破”之首。CAR是一種人工T細胞受體，主要結構包括三個部分：來源于單克隆抗體單鏈可變區的抗原識別區、跨膜區和來源于CD3ζ和（或）共刺激分子的胞內信號轉導區。CAR-T在治療難治性復發性B細胞急性淋巴細胞白血病的早期臨床試驗中獲得巨大成功，完全緩解率高達70%?90%。然而，CAR-T在治療其他CD19陽性的血液腫瘤（如慢性淋巴細胞白血病）時效果卻要差很多，總體反應率在50%左右，可能與T細胞免疫檢查點介導的免疫抑制性信號有關，導致T細胞耗竭。同樣，由于腫瘤免疫抑制性微環境的影響，CAR-T治療實體瘤更是差強人意。
通常所說的免疫抑制性信號通路是指免疫檢查點（immune checkpoints）在腫瘤免疫逃逸中發揮重要作用，尤其是選擇性抑制腫瘤特異性T細胞的功能。
淋巴細胞活化基因-3（lymphocyte activation gene-3, LAG-3）是一種重要的免疫檢查點，在調節T細胞免疫應答中發揮著十分微妙的作用。LAG-3的結構與CD4相似，配體都是MHC II類分子，但親和力比CD4要高。此外LAG-3也會與LSECTin發生交聯反應。LSECTin分子是一種C型凝集素，屬于DC-SIGN家族，主要表達于樹突狀細胞，也會表達在某些腫瘤組織中。LAG-3主要表達于活化后的效應T細胞、調節性T細胞、自然殺傷細胞、B細胞及漿細胞樣樹突狀細胞。
越來越多的證據表明，無論在體內還是體外，LAG-3都會負調控效應T細胞的功能（活化、細胞因子釋放和細胞殺傷），同時會增強調節性T細胞的免疫抑制功能。LAG-3還是T細胞耗竭的一個標志，在腫瘤和慢性感染環境中，LAG-3的表達會在T細胞表面明顯上調，通過單克隆抗體阻斷LAG-3，會增強T細胞的增殖和細胞因子釋放，而且會延遲細胞周期停滯，增加記憶T細胞亞型的比例。在慢性感染和腫瘤的臨床前研究發現，PD-1和LAG-3在促進免疫逃逸的過程中發揮協同作用，同時阻斷PD-1和LAG-3信號通路可以逆轉T細胞耗竭，提高T細胞抗感染和抗腫瘤的能力。目前單獨使用LAG-3抗體或聯合使用PD-1抗體和LAG-3抗體治療血液腫瘤和實體瘤的臨床試驗正在進行。
過繼性細胞輸注前，體外通過靶向基因編輯技術永久敲除CAR-T細胞上的免疫檢查點受體如PD-1和LAG-3，也許能夠提高CAR-T的功能，而且能夠避免長期系統使用單克隆抗體所帶來的潛在副反應。有研究報道在T細胞或CAR-T細胞中敲除PD-1能夠增強T細胞或CAR-T細胞抗腫瘤功能。但目前還沒有關于T或CAR-T細胞敲除LAG-3的報道。我們的研究首次利用CRISPR-Cas9系統在T細胞和CAR-T細胞中進行LAG-3的敲除，并觀察基因編輯后的T和CAR-T細胞免疫表型和功能變化。
我們利用CRISPR-Cas9技術，能夠有效地在T細胞和CAR-T細胞中進行LAG-3基因敲除。與以往的小鼠體內研究不同，我們沒有發現LAG-3敲除后T和CAR-T細胞增殖能力增加。此外，電轉程序不會明顯影響T和CAR-T細胞免疫表型，以中央記憶性T細胞為主。LAG-3敲除的CAR-T細胞能夠維持抗原特異性細胞因子釋放和體內外抗腫瘤功能。
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然而，先前的研究發現通過單克隆抗體阻斷LAG-3后會增加抗原特異性T細胞細胞因子釋放水平和體內外對腫瘤細胞殺傷功能。我們目前的研究沒能證明LAG-3敲除后的優勢。一個可能的原因是我們的小鼠腫瘤模型不能模擬免疫抑制性腫瘤微環境，因此不能顯出LAG-3敲除CAR-T抵抗T細胞耗竭的優勢。另一方面，LAG-3和PD-1在介導腫瘤免疫逃逸的過程中發揮協同作用，單獨阻斷LAG-3的功能可能不足以提高CAR-T細胞抗腫瘤的功效。因此，還需要進一步研究PD-1和LAG-3同時敲除的CAR-T細胞，并在能夠更好模擬腫瘤微環境的小鼠模型如病人來源腫瘤細胞移植模型上驗證其功能。
總之，我們目前建立了利用CRISPR-Cas9系統在T細胞或CAR-T細胞中高效敲除LAG-3的方法，而LAG-3敲除CAR-T的潛在優勢需要進一步研究，利用靶向基因編輯技術敲除免疫檢查點是改進CAR-T治療實體瘤非常有希望的策略。
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