靶向測序：表達譜分析的新選擇

　　沒有人愿意聽到“癌癥”這個詞。不過在提到前列腺癌時，人們的情緒往往更加復雜：有些人的腫瘤不會擴散，需要積極監控；而有些人就沒那么幸運，需要手術或放療和化療。醫生所面臨的挑戰是正確的診斷，再加上適當的治療。

　　Carlos S.Moreno是埃默里大學溫希普癌癥研究所（Winship Cancer Institute）的副教授。他和他的同事決定尋找生物標志物，來幫助分類。他們選擇的分析是RNA測序（RNA-seq）。研究小組從106個前列腺樣本中提取RNA，去除核糖體RNA，合成cDNA并制備測序文庫。在分析了大量堿基之后，研究小組發現了與腫瘤進展密切相關的基因表達特征。

　　“我們確定了一組共24個基因，能非常準確地判定手術后會復發的患者，”Moreno談道。“它比一些市售的分析集合更好，而且它有望檢測侵襲性的前列腺癌。”

　　當研究人員尋找生物標志物，但又不知去哪里尋找時，這種策略很有意義。不過，全轉錄組的RNA-seq實驗從資金和計算角度來看都是昂貴的，于是研究人員改為關注轉錄組的一小部分，以降低復雜性。

　　長短結合

　　與芯片和qPCR的方法不同，NGS是“無偏向的”，它不需要研究人員提前知道它們要找什么。它顯示了每條序列有多少分子存在，以及轉錄本結構和序列變異的細節。不過，這都取決于實驗如何運行。

　　Illumina的測序儀將長的DNA打斷成數千萬甚至上億個片段，每個的長度為幾百個堿基。它的測序深度意味著研究人員通常可以識別罕見的序列，但這也讓轉錄本的組裝很復雜，也就是說，弄清楚哪些外顯子是在同一條轉錄本上。

　　Pacific Biosciences產生的讀取更長，但較少，每四小時的運行大約產生75,000條讀取，讀長平均為10,000bp。這讓研究人員能夠從頭到尾地讀取轉錄本，這在鑒定新穎的轉錄本異構體時特別有用。

　　考慮到這兩種方法的優勢互補，許多研究人員在轉錄組分析時綜合了PacBio和Illumina的方法。

　　麻煩的是，NGS的好處是隨測序深度而增加。因此，盡管RNA-seq能檢測到新穎的轉錄本和異構體，“但實際上，大多數人都不會測得那么深，”Affymetrix表達業務部的首席科學家Anthony Schweitzer說。為了平衡預算和規模，研究人員往往在每個測序通道中擠進多個樣品，降低每個樣品的成本及測序深度。高豐度的轉錄本會大量占用測序讀取，導致罕見的轉錄本可能永遠都看不到。

　　2014年9月，測序質量控制（SEQC）項目發表了RNA-seq測序性能的跨平臺分析結果。2他們利用Illumina、Life Technologies和羅氏的測序技術，在10個實驗室中測序了兩個參考RNA樣本。之后，他們將超過10Tb的數據與芯片和qPCR的數據集進行比較。

　　研究小組發現，全面捕獲人類轉錄組的豐富性相當難。據Illumina的產品營銷主管KevinMeldrum介紹，對于表達譜分析，Illumina建議獲得1000萬條讀取，而發現性的工作需要5000萬條讀取。然而，SEQC研究人員甚至在10億條讀取中仍檢測已知的轉錄本。

　　新型策略

　　靶向測序讓研究人員能夠最大限度利用他們的測序運行，將精力集中在那些感興趣的序列上。例如，Moreno正在測試一種109個基因的集合，其中包括他之前鑒定出的24個基因。為了獲得那些數據，Moreno利用Cellular Research的Precise?MolecularIndexing分析，來捕獲樣本中的目標序列。

　　Precise分析讓研究人員能夠在cDNA合成和擴增過程中引入6500條獨特的序列條形碼，以克服擴增偏向，并準確估計轉錄本的豐度。通過計算條形碼，而不是讀取，研究人員能夠確定每條轉錄本有多少個拷貝。Cellular Research的銷售經理Martin Pieprzyk解釋：“這就像一張電影票。即使我復制10份，你也知道它們是副本，因為每個都有唯一的編號。”

　　Moreno表示，他之所以選擇Precise方法，是因為這種分析能處理極少量的RNA，這是exosome研究的一個關鍵因素。此外，這項技術也能降低實驗成本。“由于只測序少數基因，那么你可以在單個通道中對多個患者的樣本進行多重分析，”他說。據他估計，成本會降低一個數量級，甚至更多。

　　其他公司也推出了替代的靶定策略。Illumina有TruSeq TargetedRNA Expression試劑盒，覆蓋p53和Wnt等信號通路，也能添加12-1000個基因的定制分析。據Meldrum介紹，此試劑盒與MiSeq和Next Seq 500測序儀兼容，是基于靶向序列的PCR擴增。

　　羅氏Nimble Gen也提供四種Seq Cap RNA試劑盒：富集長鏈非編碼RNA的預設計試劑盒，以及捕獲多達100Mb人類序列目標或200Mb非人類或非傳統轉錄組的定制試劑盒。

　　傳統方案

　　當然，研究人員也可以利用傳統的PCR來靶定。在最近一項研究中，瑞典烏普薩拉大學的研究人員利用這種方法來尋找慢性髓性白血病（CML）中的BCR-ABL1突變。研究小組從6名CML患者的血液或骨髓樣本中擴增出1.6kb的BCR-ABL1cDNA，并在Pac Bio系統上測序，產生約32,000條讀取。3

　　研究小組能夠發現Sanger測序錯過的突變，并區分同一轉錄本上的突變。他們還發現新的轉錄本異構體。“這很驚人，因為基因融合的發現已經有20年了，”PacBio的首席科學家Jonas Korlach指出。“你覺得一切都是已知的，但有了新的技術，我們看到了新的東西。”