噬菌體ELISA
使用0.3ug的FGFR3，FGFR1或者人IgG蛋白包被微孔板，洗滌，封閉，加入不同濃度前面篩選純化后的噬菌體懸浮液。孵育后，加入HRP-抗M13抗體，加入底物顯色，450nm讀取結果。
單克隆噬菌體ELISA
經過兩輪或三輪的篩選后收獲的噬菌體經過培養生長出克隆，然后使用QPix高通量自動化克隆篩選系統(Molecular
Devices)挑取單克隆到含有100ul
2TY培養基的96微孔板，37度培養，第二天使用相同培養基對培養物1:100稀釋，然后37度震蕩培養2小時，加入25ul含有109輔助噬菌體KM13的2TY培養基，繼續培養1小時。菌體經過離心，重懸于2TY培養基，30度過夜培養。最后，離心，取50ul上清，進行單克隆噬菌體ELISA分析。
可溶性scFv抗體的表達純化和ELISA檢測
獲得的高特異性克隆，使用E.coli
HB2151誘導表達，離心收獲菌體，提取細菌周質腔蛋白，最后使用親和色譜純化。純化的各組分使用SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色分析。純化的組分進一步使用分子篩層析分離出scFv蛋白的單體(scFv容易發生二聚體或者多聚體)。
表面等離子體共振分析
使用BiacoreX分析可溶性scFv和FGFR3的結合動力學，并且計算獲得每個純化的scFv的Kd值；使用競爭性結合分析確定每個scFv的特異性結合位點。使用同樣的方法分析scFvs和FGF9，FGF1以及EGF是否能競爭結合FGFR3。
流式細胞儀和共聚焦顯微鏡分析
使用流失細胞儀分析噬菌體scFv和純化后可溶性scFv在細胞水平上和FGFR3的結合活性。通過處理RT112細胞，然后使用共聚焦顯微鏡進一步分析抗體結合活性。
細胞增殖分析
使用不同濃度的抗FGFR3 scFvs抗體(0.02-2umol/L)處理RT-112細胞，48小時后，使用MTT對細胞進行染色，然后570nm讀數。細胞活力通過下面公式計算：Abs-scFv處理的細胞/Abs-對照組細胞。
結果
篩選FGFR3特異性scFv抗體：如表1所示，總共隨機挑選了288個克隆，通過ELISA檢測，獲得15個FGFR3特異性的抗體克隆。通過測序發現，15個克隆里面有6個克隆的序列是唯一的。3A和1D序列內部有一個終止密碼子，只在VL的CDR2區有一個堿基突變。其他4個克隆的序列有比較大的區別，主要區別集中在CDR2和CDR3。其中CDR3在VH和VL都是高度可變的，CDR2的突變主要集中在VH。
ELISA特異性鑒定發現：如圖2所示，盡管FGFR1和FGFR3具有高度同源性(>62%)，6個篩選到的scFv克隆都對FGFR3具有顯著的結合特異性；相反和FGFR1的結合活性非常弱，和陰性對照人IgG的反應結果類似。
圖2：ELISA檢測篩選到的可溶性scFvs結合特異性。從培養上清中獲得的scFv-pIII融合蛋白，通過ELISA方法檢測和FGFR3-Fc(黑色)，FGFR1-Fc(灰色)以及陰性對照人IgG(白色)的結合活性。
使用Biacore分析了純化后單體scFv抗體和FGFR3的親和力。如表2所示，檢測了不同scFvs的Kon，Koff以及Kd值。Kd值在40.9和12.4nmol/L之間變化，表明篩選到的scFv具有中等到較高的親和活性。如果考慮了使用的噬菌體的庫容只有1.6*108，屬于中等大小庫容，這個結果已經非常好了。
