韓春雨詳解新版實驗方法稱新舊實驗方法無本質區別

　　 8月8日，河北科技大學副教授韓春雨向非營利性質粒共享信息庫Addgene提交新版的詳細實驗方法，并補充了數項應當注意的問題。

　　此前，韓春雨領導的課題小組發明新的基因編輯技術NgAgo－gDNA，被國內媒體譽為做出“諾獎級”實驗成果。然而，論文發表兩個月后，全球仍沒有一家實驗室對外宣布能夠完全成功重復韓春雨的實驗，多國科學家要求發表韓春雨論文的《自然-生物技術》介入調查并公開實驗中的所有原始數據和實驗條件，該期刊表示將按照既定流程來調查此事。

　　10日，韓春雨獨家回應南方都市報，表示其他科學家無法復制實驗結果的原因，他也在研究，但目前不能隨便下定論，必須有科學的結論才能發聲。目前提交的新實驗方法是在和其它科學家討論之后得出的，其中最有價值的部分是提出了一些注意事項。

　　新版實驗步驟有四處變化 增加四個注意事項

　　5月2日，韓春雨課題組的論文《NgAgo DNA單鏈引導的基因編輯工具》在《自然-生物技術》網絡版發表，隨后引起了廣泛關注。韓春雨小組得出的結果是以DNA來介導NgAgo（一種核酸內切酶）對靶向基因的識別從而進行基因編輯，被認為是基因編輯領域的一項重大突破。

　　韓春雨因此走紅網絡，被許多人視為在普通學校也能做出一流科研成果、耐得住寂寞搞科研的典型樣本。同時有觀點認為，NgAgo將取代CRISPR成為新一代主流的基因編輯技術。不過，韓春雨本人對此相當謹慎。他曾在接受媒體采訪時表示，NgAgo系統和CRISPR都為基因編輯應用提供了更好的工具和多樣化的選擇，各有各的用處。

　　然而，在論文發表后的兩個多月后，沒有一家科研團隊宣布成功重復出韓春雨的實驗結果，使得這項新基因編輯技術受到極大的質疑。

　　8月8日，河北科技大學副教授韓春雨向非盈利性質粒共享信息庫Addgene網站提交新版的詳細實驗方法，南都記者看到，其中一些實驗步驟與其在《自然-生命科學》中發表的論文有所不同。

　　據“科學美國人”中文版《環球科學》的微信公眾號“科研圈”介紹，新版實驗步驟有幾處變化：

　　1.血清品牌由 Hyclone 變更為Gibco；

　　2.增加了關于“293T 細胞貼壁不牢，換液時要小心操作”的小提示；

　　3.建議在質粒/gDNA共轉染的時間從“24小時”變成了8小時、12小時或24小時后；

　　4.溶解和稀釋質粒及 gDNA 的緩沖液從含有 EDTA 的0.5xTE變更為水（pH 8.0）。

　　此外，實驗步驟之后還有“在實驗前要仔細確認所使用的細胞株未被污染或污染已被徹底清除”、“在細胞消化和培養過程中要避免使用金屬離子螯合劑 EDT。也可以在培養基中額外加入 5 mM或其他濃度的鎂離子”等四條注意事項。

　　有研究者認為，新版實驗步驟第三條提到的補轉gDNA和第四條中緩沖液的變化，尤為關鍵。

　　值得注意的是，實驗步驟后補充的四條注意事項中， EDTA 再次被強調。據了解，EDTA是一種金屬離子螯合劑，可以螯合鎂離子，而根據韓春雨補充的說明，鎂離子恰恰是 NgAgo 系統發揮作用的必要條件。有學者認為，此前多國學者無法重復實驗結果，或許就是EDTA“神不知鬼不覺”地產生了影響。

　　新方法公布后 爭議仍未止息

　　此前，由于多國科學家無法重復出實驗結果，有人質疑韓春雨在論文中隱瞞了實驗的關鍵條件。 “《自然-生物技術》應該要求韓向公眾公開他所有的原始數據和實驗條件，這是學術期刊的義務。”質疑者之一的布爾焦說。

　　新版方法剛剛公布，尚未有人公開聲稱調整后的方法有效。一位重復實驗結果失敗的國內研究者則對南都說，實驗時確實沒有注意到新版方法中涉及的細節，將在近期繼續嘗試。他對重復成功表示了審慎樂觀。

　　但在NgAgo的谷歌討論組內，爭議仍未止息。名為Jonathan Geisinger的用戶認為，新版實驗方法并不具備足夠的說服力。名為SL的用戶則表示，問題的關鍵仍然在于韓春雨如何達到論文中21%-41%基因編輯效率，新步驟看起來不足以讓那些重復實驗失敗的人將效率提高到20%以上。

　　《自然-生物技術》：暫未取得可公開的調查進展

　　8月8日，《自然-生物技術》發言人稱，將按既定流程調查韓春雨的研究。“已有若干研究者聯系本刊，表示無法重復這項研究，”發言人說，“《自然-生物技術》對于人們提出的任何關于論文的疑慮都會認真對待，并加以慎重考慮。”

　　發言人同時表示，作為在自然科研旗下期刊發表論文的條件之一，作者須將材料、數據、代碼和相關的實驗流程及時向讀者提供，不可加以不當限制。

　　有研究者認為，韓春雨新公布的實驗方法發生了變化，但這并不意味著韓春雨違反《自然-生物技術》的要求，在此前的論文中隱瞞了實驗的關鍵條件。

　　以新步驟中緩沖液的變化為例，這名研究者說，基因編輯的實驗中，用水和含有EDTA的0.5xTE做緩沖液都很常見，大多取決于研究者的個人習慣，可能正因為此，韓春雨在此前的論文中沒有特別強調避免EDTA的影響。

　　10日下午3時許，《自然》工作人員對南方都市報記者表示，目前韓教授沒有將最新的實驗方式提交給雜志社，因此不好發表評論。此外，對于期刊此前聲明對韓春雨論文的調查，暫時沒有可以對外公開的進展。

　　獨家對話韓春雨

　　10日，韓春雨獨家回應南方都市報，表示新提交的實驗方法，當中最有價值的部分是提出了一些注意事項，如避免細胞的污染。韓春雨稱，這些新的實驗方法是在和其它科學家討論之后得出的，此前自己只是從自己的經驗、習慣出發去撰寫實驗方法，對別人可能遇到的問題考慮不周全。

　　韓春雨對南都記者表示，其他科學家無法重復的原因，他也在探究，但目前不能隨便下定論，“重復性到底是由什么決定的，比如我們認為是細胞污染，那我們必須有科學的結論才行，要拿出證據，不能隨口一說。”

　　韓春雨認為，這些研究工作并不是他一個人的責任，所有的科學家都可以做的，“這一個東西提出來之后，其實就是提供給全世界了，讓全世界科學家一起去解決這里面的問題。”

　　對于是否有人已經復制成功，對實驗結果是否仍然有信心，韓春雨表示，《自然》的最新報道是最全面的，除此之外均不作回應。

　　南都：最近你向質粒共享信息庫 Addgene 提交了更詳細的新版實驗方法，其中補充了數項應特別注意的問題。為什么會作出這些改變？

　　韓春雨：第一個關于血清的品牌的改進并不重要，只要保證是熱滅活的血清就可以；第二個補充DNA guide時間，這是要根據細胞的傳代速度和蛋白表達時間來決定的。每個實驗室里的細胞都不同，所以需要根據實驗用細胞的蛋白表達時間去補加DNA guide，這個是需要摸索的。而以前的方法是根據我當時的實驗確定的；第三個改進，將緩沖液從含有 EDTA的TE換成PH8的水，主要是因為NgAgo需要鎂離子，我們要盡量去掉所有含有EDTA的試劑。

　　南都：此前為什么沒有提出這些注意事項？

　　韓春雨：通過最近和其他一些研究者交流，我認為這些可能會被研究者忽視。

　　南都：最新提交的實驗方法與原來的實驗方法有什么不同？

　　韓春雨：原則上沒有本質區別，但增加了需要特別注意的事項，例如避免使用污染的細胞；還有一些細節，例如如何磷酸化ssDNA，以及避免Mg離子損失。

　　南都：這次提交新的試驗方法，最重要的價值在哪里？

　　韓春雨：新的實驗方法當中最重要的部分是根據實驗室經驗提出了一些注意事項，排在前面的是最重要的。在我們注意事項中的第一點，就是NgAgo系統對細胞的污染，包括支原體、寄生菌的污染極其敏感，避免使用污染的細胞。

　　南都：你認為是細胞的污染導致很多科學家無法復制你的實驗嗎？

　　韓春雨：其他科學家無法重復的原因，我們也在研究。但必須要作出科學的結論來才行，不能隨口一說。比如用污染的細胞和不污染的細胞對比，以及這些污染到底是什么。

　　其實這個工作是所有科學家都可以做的。比如說他會去研究污染如何對NgAgo系統起作用，可以作為科研論文去發表。我們的經驗分享給大家，別人有經驗也可以去分享，這就是科學的態度。

　　南都：你是怎么得出這一新的實驗方法的？

　　韓春雨：這是跟別人在討論當中發現的，有一些我們也在優化。一個技術出來，它的優化是需要不斷進行的，每次都可能有一些小的進步。比如在細胞培養液中添加鎂離子效果更好。

　　南都：為什么選擇Addgene這個平臺，而不是原來發表期刊的《自然-生物技術》？

　　韓春雨：這是兩個不同的渠道，Addgene是一個非營利機構，主動聯系我們的，他們希望我們提供一份詳細的protocol，所以我就提交了。這是一個研究人員共享的平臺。

　　事件回顧

　　5月2日，韓春雨課題組的論文《NgAgo DNA單鏈引導的基因編輯工具》在《自然-生物技術》網絡版發表；

　　5月-7月，研究成果受到學界和社會的廣泛關注，韓春雨走紅；谷歌在線聊天群組等網絡社區內，無法重復實驗結果的質疑聲也陸續出現；

　　7月14日，方舟子發博文質疑韓春雨，稱國內多家實驗室反映他們重復不出韓春雨論文的實驗結果；

　　7月29日，一度對重復實驗表示樂觀的澳大利亞大學研究中心學者蓋坦·布爾焦（Gaetan Burgio）公開發文稱無法再現韓春雨論文的結果，將質疑聲推向高潮；

　　8月2日，《自然-生物技術》宣布將按照既定流程對研究進行調查；

　　8月8日，韓春雨向質粒共享信息庫 Addgene 提交更詳細的新版實驗方法，其中補充了數項應特別注意的問題。