顏寧團隊：RyR2的8個冷凍電子顯微鏡（cryoEM）結構

　　心肌收縮是由Ca²⁺進入細胞質引起的，最初來自細胞外環境，由Cav1.2介導，隨后由肌漿網Ca²⁺儲存，由RyR2介導。 Ryanodine受體是已知最大的離子通道，由分子量大于2兆道爾頓的同源四聚體組成。超過80％的蛋白質折疊成多結構域，感知與各種調節劑的相互作用，從離子到蛋白質。 RyR2活性的精確調節對于每次心跳都是至關重要的， RyR2的異常活動與危及生命的心律失常相關。高電導細胞內鈣（Ca²⁺）通道RyR2對于心肌的激發和收縮的耦合是必不可少的。在各種調節劑中，鈣調蛋白（CaM）以Ca²⁺依賴性方式調節RyR 2。

　　2019年7月5日，顏寧等人于Nature發表題為“Modulation of cardiac ryanodine receptor 2 by calmodulin”的研究論文，該研究報道了RyR2的8個冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，它們共同揭示了不同形式CaM的分子識別特征，并提供了對CaM對RyR2通道門控的調節的見解。Apo-CaM和Ca²⁺-CaM結合由手柄，螺旋和中心區域形成的細長裂縫中的不同但重疊的位點。RyR2上CaM結合位點的轉變受Ca²⁺與CaM結合而不是RyR2的控制。Ca²⁺ -CaM誘導各個中心結構域的旋轉和域內移位，導致PCB95和Ca²⁺激活的通道的孔閉合。相比之下，ATP，咖啡因和Ca²⁺激活通道的孔在Ca²⁺-CaM存在下保持開放，這表明Ca²⁺-CaM是RyR2門控的許多競爭調節劑之一。

　　L型電壓門控Ca²⁺（Cav）通道由各種化合物調節，例如1,4-二氫吡啶（DHP），苯并硫氮雜卓（BTZ）和苯基烷基胺（PAA），其中許多已被用于表征通道性質和用于治療高血壓和其他疾病。2019年5月30日，顏寧及吳建平共同通訊在Cell在線發表題為“Molecular Basis for Ligand Modulation of a Mammalian Voltage-Gated Ca²⁺ Channel”的研究論文，該研究報告了Cav1.1與拮抗藥物硝苯地平，地爾硫卓和維拉帕米的復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，分辨率分別為2.9?，3.0?和2.7?；Cav1.1與DHP激動劑Bay K 8644復合物的冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，分辨率為2.8?。地爾硫卓和維拉帕米穿過孔域的中心腔，直接阻斷離子滲透。盡管硝苯地平和Bay K 8644在重復III和IV的界面處占據相同的位點，但協調細節支持以前的功能觀察。這些結構闡明了不同Cav配體的作用模式，并為結構引導的藥物發現建立了框架。總之，結構研究闡明了三種臨床應用的拮抗劑和原型激動劑在原子水平上識別和調節L型Cav通道的分子基礎，并為大量實驗和臨床數據提供結構解釋。這些結構為未來針對Cav通道病的藥物發現奠定了基礎。2019年5月24日，顏寧及龔欣共同通訊在Nature Communications在線發表題為“Inhibition of tetrameric Patched1 by Sonic Hedgehog through an asymmetric paradigm”的研究論文，該研究報告四聚體Ptch1與Sonic hedgehog（ShhNp）的棕櫚酰化N-末端信號傳導結構域的冷凍-EM結構，以4：2的化學計量比復合。該結構顯示四個Ptch1被組織為二聚體的疏松二聚體，每個二聚體通過兩個不同的抑制界面與一個ShhNp結合，一個主要通過ShhNp的N-末端肽和棕櫚酰基部分，另一個通過ShhNp上的Ca2 +介導的界面。該結構闡明了Ptch1的四聚體組裝，并提出了Hh配體的不對稱作用模式，用于抑制Ptch1的潛在膽固醇轉運活性。總之，與棕櫚酰化ShhN以4：2化學計量比復合的四聚體Ptch1的結構進一步完成了Ptch1和Shh之間相互作用的分子圖譜，為將來研究Hh信號傳導設定了重要的框架。

RyR2-CaM復合物的Cryo-EM結構

　　17kDa的CaM蛋白是一種重要的鈣傳感器，在大多數鈣信號傳導事件中起著重要作用。 CaM由大致對稱的N-和C-末端葉組成，通過柔性鉸鏈連接。每個葉可以通過兩個EF-手（螺旋E和F-手）基序與兩個Ca²⁺離子配合，具有微摩爾范圍的結合親和力。在Ca²⁺結合后，兩個葉中的幾個疏水殘基的暴露促進CaM與靶序列的結合。 CaM與ryanodine受體直接相互作用，CaM-RyR的化學計量比為1：1，在納摩爾范圍的結合親和力。

CaM和RyR2之間的接口

　　然而，CaM對ryanodine受體的調節是同種型特異性的。 CaM顯示RyR1的雙相調節，作為納摩爾水平的Ca²⁺（apo-CaM）的弱激活劑和微摩爾水平的Ca²⁺（Ca²⁺-CaM）的抑制劑。相反，apo-CaM對RyR2沒有作用或抑制作用，而Ca²⁺-CaM抑制RyR2。 CaM還被證明有助于終止存儲過載誘導的Ca²⁺釋放（SOICR）。 CaM和RyR2之間的異常相互作用與心力衰竭相關，CaM-RyR2相互作用受損的糾正可以作為壓力超負荷引起的心力衰竭致死性心律失常的治療。

Ca²⁺負載后CaM結合位點移位的分子基礎

　　RyR-CaM復合物的結構表征局限于低分辨率電子顯微鏡圖，其表明在RyR1中對于apo-和Ca²⁺-CaM存在兩個重疊但不同的結合位點。對應于RyR1的殘基3614-3643（RyR2的中心結構域中的殘基3581-3612）的肽結合apo-CaM和Ca²⁺-CaM。與肽結合的Ca²⁺-CaM的晶體結構揭示了肽的N和C末端的疏水錨，其分別容納Ca²⁺-CaM的C-和N-葉。

通過CaM調制RyR2的示意圖

　　為了闡明CaM對RyR2的調節，該研究報道了RyR2的8個冷凍電子顯微鏡（cryo-EM）結構，它們共同揭示了不同形式CaM的分子識別特征，并提供了對CaM對RyR2通道門控的調節的見解。Apo-CaM和Ca²⁺-CaM結合由手柄，螺旋和中心區域形成的細長裂縫中的不同但重疊的位點。RyR2上CaM結合位點的轉變受Ca²⁺與CaM結合而不是RyR2的控制。Ca²⁺-CaM誘導各個中心結構域的旋轉和域內移位，導致PCB95和Ca2 +激活的通道的孔閉合。 相比之下，ATP，咖啡因和Ca²⁺激活通道的孔在Ca²⁺-CaM存在下保持開放，這表明Ca²⁺ -CaM是RyR2門控的許多競爭調節劑之一。

　　參考信息：

　　https://www.nature.com/articles/s41586-019-1377-y