在ToF質譜儀中，我們可以通過某個離子飛越一段長度真空管道的時間推算出它的質荷比（mass-to-charge ratio）。現在，ToF質譜儀的性能已經得到了很大的提升，尤其是在分辨率和準確性方面進步最為明顯。現在，分辨力超過12，000已經是質譜儀的常規標準了。如果按照正確的操作規程，也可以達到百萬分之一（ppm）級別的準確率。ToF質譜儀是進行ESI質譜和MALDI質譜檢測的基礎平臺。Q-Q-ToF質譜儀在MS模式和MS/MS模式下就具有非常高的分辨率和準確率。在MS模式下，四級桿（quadrupole）起到了引導離子飛行的作用。而在MS/MS模式下，母離子（precursor ions），即在ESI過程中產生的離子被“挑選”出來，進入第一對四級桿，而后在第二對四級桿中借助碰撞誘導解離作用（collision-induced dissociation）被裂解。然后，裂解離子產物經由ToF質譜儀進行分析處理。不論是完全掃描模式（full-scan）還是MS/MS模式，得到的質譜圖都具有很高的準確率和分辨率，這也就意味著能獲得更多的肽段信息，發現單一同位素信號（mono-isotopic signal）的離子狀態和指派（assignment）信息。所有這些信息都給蛋白質鑒定工作帶來了極大的便利。有了上述這些信息，再與數據庫中的數據進行比對，就能找出檢測蛋白質樣品的資料。Q-Q-ToF質譜儀在定量分析方面以及蛋白質翻譯后修飾情況分析方面的能力也同樣出色。
MALDI技術是另一項非常有用的待測蛋白質樣品離子化技術，通常都會將MALDI技術與ESI技術相互補充使用。MALDI質譜儀靈敏度非常高，同時，對樣品污染（比如，鹽離子污染或少量去垢劑污染等）的要求沒有ESI質譜儀那么苛刻。最開始，MALDI技術是與ToF質譜儀聯合使用用來檢測蛋白質分子量的。后來又被應用到Q-Q-ToF質譜儀和ToF-ToF質譜儀上，這樣才實現了真正的MS/MS檢測。在單電荷（singlycharged）母離子的質譜圖和ToF-ToF質譜儀得到的質譜圖中都能發現高能量的碰撞裂解片段，這些片段都是蛋白質多肽肽鍵斷裂和側鏈斷裂形成的，這些信號都很容易被解析。