食品中蛋白質及氨基酸的測定方法介紹

一、概述

在食品加工過程中,蛋白質及其分解產物對食品的色、香、味和產品質量都有一定的影響,測定食品中蛋白質的含量,對于評價食品的營養價值,合理開發利用食品資源,指導生產,優化食品配方,提高產品質量具有重要的意義。

測定蛋白質的方法可分為兩大類:一類是利用蛋白的共性,即含氮量、肽鍵和折射率等測定蛋白質含量;另一類是利用蛋白質中特定氨基酸殘基、酸性和堿性基團以及芳香基團等測定蛋白質含量。蛋白質測定最常用的方法是凱氏定氮法,它是測定總有機氮的最準確和操作較簡便的方法之一,在國內外應用普遍。此外雙縮脲分光光度比色法、染料結合分光光度比色法、酚試劑法等也常用于蛋白質含量的測定,由于方法簡便快速,多用于生產單位質量控制分析。近年來,國外采用紅外檢測儀對蛋白質進行快速定量分析。

蛋白質可以被酶、酸或堿水解的最終產物為氨基酸。它們對人體有著極其重要的生理功能,常會因其在體內缺乏而導致患病或通過補充而增強了新陳代謝作用。隨著食品科學的發展和營養知識的普及,食物蛋白質中必需氨基酸含量的高低及氨基酸的構成,越來越得到人們的重視。為提高蛋白質的生理效價而進行食品氨基酸互補和強化的理論,對食品加工工藝健食品的開發及合理配膳等工作都具有積極的指導作用。因此,食品及其原料中氨基酸的分離、鑒定和定量也具有極其重要的意義。

氨基酸的測定方法也很多,如酸堿滴定法(雙指示劑滴定法、電位滴定法)、茚三酮比色法等。食品中氨基酸含量的測定通常采用酸堿滴定法。近年來世界上出現了多種氨基酸分析儀、近紅外反射分析儀,都可以快速、準確地測出氨基酸含量。

二、蛋白質的測定凱氏定氮法

新鮮食品中的含氮化合物大多以蛋白質為主體,不同的蛋白質含氮量不同。一般蛋白質含氮量為16%,即1份氮素相當于6.25份蛋白質,此數值稱為蛋白質系數。不同種類食品的蛋白質系數不同,如玉米、蕎麥、青豆、雞蛋等為6.25;花生為5.64;大米為5.95;大豆及其制品為5.71;小麥粉為5.70;高粱為6.24;大麥、小米、燕麥等為5.83;牛乳及其制品為6.38;肉與肉制品為6.25;芝麻、向日葵為5.30。所以檢驗食品中蛋白質時,往往測定總氮量,然后乘以蛋白質換算系數,即可得到蛋白質含量。凱氏定氮法可用于所有動物性、植物性食品的蛋白質含量測定,它的最低檢出量為0.05mg氮,相當于0.3mg蛋白質。但因樣品中常含有核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質的含氮化合物,故通常將測定結果稱為粗蛋白質含量。

凱氏定氮法由Kieldahl于1833年首先提出,經長期改進,迄今已演變成常量法、微量法、改良凱氏定氮法、自動定氮儀法、半微量等多種方法。

1、常量凱氏定氮法

1)原理

樣品與硫酸和催化劑一同加熱后消化,使蛋白質分解,其中的碳和氫分別被氧化成二氧化碳和水蒸氣逸出,而有機氮轉化成氨后與硫酸結合生成硫酸銨,然后在堿性條件下蒸餾使氨游離,用硼酸吸收后再用硫酸或鹽酸標準溶液滴定,根據酸的消耗量乘以換算系數,即得蛋白質含量。以甘氨酸為例,該過程的反應方程式如下:

消化    2NH₂(CH₂)₂COOH+13H₂SO₄→(NH₄)₂SO₄+6CO₂+12SO₂↑+16H₂O

蒸餾    (NH4)₂SO₄+2NaOH--2H₂O+Na₂SO₄+2NH₃↑

吸收    2NH₃+4H₃BO₃-(NH₄)₂B₄O₇+5H₂O

滴定    (NH4)2B4O7+2HCl+5H₂O  2NH₄CI+4H₃BO₃

在消化過程中,濃硫酸具有脫水性和炭化性,使有機物脫水并炭化為碳、氫、氮。濃硫酸又有氧化性,使炭化后的碳氧化為二氧化碳硫酸則被還原成二氧化硫:

 2H₂SO₄-2SO₂+2H₂O+CO₂↑

二氧化硫使氮還原為氨,本身則被氧化為三氧化硫氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中:

 H₂SO₄+2NH₃-(NH₄)₂SO₄

在消化反應中,為了加速蛋白質的分解,縮短消化時間,常加入下列催化劑。

①硫酸鉀    加入硫酸鉀的目的是為了提高溶液的沸點,加快有機物的分解。硫酸鉀與硫酸作用生成硫酸氫鉀可提高反應溫度,一般純硫酸的沸點為340℃左右,而添加硫酸鉀后,可使溫度提高至400℃以上,而且隨著消化過程中硫酸不斷地被分解,水分不斷逸出而使硫酸氫鉀的濃度逐漸增大,故沸點不斷升高,其反應式如下:

 K₂SO₄+H₂SO₄--2KHSO₄

 2KHSO₄-K₂S0₄+H₂O↑+SO₃

但是,硫酸鉀的加入量也不能太大,否則消化體系溫度過高,又會引起已生成的銨鹽發生熱分解析出氨而造成損失:

(NH₄)₂SO₄→NH₃↑+(NH₄)HSO₄

2(NH₄)HSO₄ 2NH₃↑+2SO₃↑+2H₂O

2CuSO₄ Cu₂SO₄+SO₂↑+O₂↑

除硫酸鉀外,也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類來提高沸點,但效果不如硫酸鉀。

②硫酸銅    硫酸銅在消化中起催化劑的作用。并且,藍色的硫酸銅溶液還可指示消化終點的到達,以及下一步蒸餾時作為堿性反應的指示劑。

除硫酸銅外,凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多,還有氧化汞、汞、硒粉等,但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素,應用最廣泛的是硫酸銅。另外,使用時常加入少量過氧化氫、次氯酸鉀等作為氧化劑以加速有機物的氧化分解。

2)主要儀器

凱氏燒瓶(500mL),定氮蒸餾裝置,如圖5-9所示。

圖5-9凱氏定氮消化、蒸餾裝置

1-水力真空管;2一水龍頭;3-倒置的干燥管;4一凱氏燒瓶;5,7一電爐;

6.9一鐵支架;8一蒸餾燒瓶;10進樣漏斗;11-冷凝管:12吸收瓶

3)試劑

①濃硫酸。

②硫酸銅。

③硫酸鉀。

④400g/L氫氧化鈉溶液。

⑤40g/L硼酸吸收液    稱取20g硼酸溶解于500mL熱水中,搖勻備用。

⑥甲基紅溴甲酚綠混合指示劑    5份2g/L溴甲酚綠95%乙醇溶液與1份2g/L甲基紅乙醇溶液臨用時混合均勻。混合指示劑在堿性溶液中呈綠色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈紅色。

⑦0.1000mol/L鹽酸標準溶液。

4)操作方法

準確稱取固體樣品0.2～2g(半固體樣品2～5g,液體樣品10～20mL),小心移入干燥潔凈的500mL凱氏燒瓶中,加入研細的硫酸銅0.5g、硫酸鉀10g和濃硫酸20mL,輕輕搖勻,安裝消化裝置,并將其以45°斜支于有小孔的石棉網上。用電爐以小火加熱,待內容物全部炭化,泡沫停止產生后,加大火力保持瓶內液體微沸,至液體變藍綠色透明后,再繼續加熱微沸30min。冷卻,小心加入20mL蒸餾水,待完全冷卻后,加入玻璃珠數粒以防蒸餾時暴沸。

將凱氏燒瓶蒸餾裝置連好,塞緊瓶口,冷凝管下端插入吸收瓶液面下(瓶內預先裝入50mL40g/L硼酸溶液及混合指示劑2～3滴)。放松漏斗夾子,通過漏斗加入70～80mL400g/L氫氧化鈉溶液,并搖動凱氏燒瓶,至瓶內溶液變為深藍色,或產生黑色沉淀,再加入100mL蒸餾水(從漏斗中加入),夾緊漏斗夾子,加熱蒸餾至氨全部蒸出(餾出液約250mL即可),將冷凝管下端提離液面,用蒸餾水沖洗管口,繼續蒸餾1min,用表面皿接幾滴餾出液,以奈氏試劑檢查,如無紅棕色物生成,表示蒸餾完畢,即可停止加熱。將上述吸收液用0.1000mol/L HCl標準溶液直接滴定至由藍色變為微紅色即為終點,記錄鹽酸溶液用量,同時做試劑空白(除不加樣品外,從消化開始操作完全相同),記錄空白試驗消耗鹽酸標準溶液的體積。

5)計算

式中    w——蛋白質的質量分數,%;

           c——鹽酸標準液的濃度,mol/L;

          V₀——空白滴定消耗標準液的體積,mL;

          V₁——試樣滴定消耗標準液的體積,mL;

          14——氮的毫摩爾質量,g/mmol;

           F——氮換算為蛋白質的系數;

           m——樣品質量,g。

6)說明及注意事項

①所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配制。

②消化時不要用強火,應保持和緩沸騰,注意不斷轉動凱氏燒瓶,以便利用冷凝酸液將附在瓶壁上的固體殘渣洗下并促進其消化完全。

③樣品中若含脂肪或糖較多時,消化過程中易產生大量泡沫,為防止泡沫溢出瓶外,在開始消化時應用小火加熱,并不斷搖動;或者加入少量辛醇或液體石蠟或硅油消泡劑,并同時注意控制熱源強度。

④當樣品消化液不易澄清透明時,可將凱氏燒瓶冷卻,加入30%過氧化氫2～3mL后再繼續加熱消化。

⑤若取樣量較大,如于試樣超過5g,可按每克試樣加5mL的比例增加硫酸用量。

⑥一般消化至呈透明后,繼續消化30min即可,但對于含有特別難以氨化的氮化合物的樣品,如含賴氨酸、組氨酸、色氨酸、酪氨酸或脯氨酸等時,需適當延長消化時間。有機物如分解完全,消化液應呈藍色或淺綠色,但含鐵量多時,呈較深綠色。

⑦蒸餾裝置不能漏氣。

⑧蒸餾前若加堿量不足,消化液在蒸餾時不生成氫氧化銅沉淀,此時需再增加氫氧化鈉用量。

⑨硼酸吸收液的溫度不應超過40℃,否則對氨的吸收作用減弱而造成損失,此時可置于冷水浴中使用。

⑩蒸餾完畢后,應先將冷凝管下端提離液面清洗管口,再蒸1min后關掉熱源,否則可能造成吸收液倒吸。

2、微量凱氏定氮法

1)原理

同常量凱氏定氮法。

2)主要儀器

①凱氏燒瓶(100mL)。

②微量凱氏定氮蒸餾裝置

3)試劑

①0.0100mol/L鹽酸標準溶液。

②20g/L硼酸吸收液:稱取20g硼酸溶解于1000mL熱水中,搖勻備用。

③其他試劑同常量凱氏定氮法。

4)操作方法

(1)樣品消化    精密稱取均勻固體樣品0.2～2.0g,或半固體樣品2～5g或吸取液體樣品10～20mL,小心移入100mL干燥的凱氏燒瓶中。向瓶內加入0.2g硫酸銅、3g硫酸鉀及一定量的濃硫酸(每克樣品加硫酸15mL)將凱氏燒瓶45°傾斜置于電爐上。同常量法消化至消化液呈透明藍綠色溶液時,再繼續加熱0.5h,完成消化。待消化液冷至室溫后,用蒸餾水干凈地轉入100mL容量瓶中,并用蒸餾水定容,搖勻,備用。

(2)蒸餾與吸收    連接好微量定氮裝置,于水蒸氣發生瓶內裝水至2/3容積處,加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升,以保持水呈酸性,加入數粒玻璃珠,加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。檢查裝置的氣密性。

在接收瓶內加入25mL20g/L硼酸及2滴混合指示劑,將冷凝管下端插入液面以下。準確量取消化稀釋液10mL,經漏斗加入反應管內,用少量蒸餾水沖洗漏斗。經漏斗再加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液,使呈強堿性,立即夾好漏斗夾,并加少量水于進樣漏斗中封口,以防漏氣。夾緊廢液排出口的螺旋夾,進行水蒸氣蒸餾。蒸餾至冷凝管下端的吸收液變為綠色開始計時,繼續蒸餾3min后,將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min,用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停止蒸餾。蒸餾結束時,夾緊簧夾,斷絕蒸汽,使蒸餾瓶內的溶液吸入回流管中。松開彈簧夾,從漏斗加入蒸餾水40～50mL,再通蒸汽加熱回流,將蒸餾瓶洗滌一次備用。

(3)滴定    吸收液用0.0100mol/L鹽酸標準溶液滴定至微紅色為終點。

(4)空白試驗    不加試樣,按上述操作作空白試驗。

5)計算

式中    w——蛋白質的質量分數,%;

           V₀——滴定空白蒸餾液消耗鹽酸標準液體積,mL;

           V₁——滴定樣品蒸餾液消耗鹽酸標準液體積,mL;

           c——鹽酸標準液的濃度,mol/L;

           0.014——氮的摩爾質量,g/mol;

           F——蛋白質系數;

           m——樣品質量,g;

           V₂——蒸餾所加樣品消化液的量,mL。

6)說明

①蒸餾前給水蒸氣發生器內裝水至2/3體積處,加甲基橙指示劑數滴及硫酸數毫升,以使其始終保持酸性,這樣可以避免水中的氨被蒸出而影響測定結果,同時可以指示因水蒸氣氣壓不足而使氨氣發生倒吸溶于水中,使得測定結果偏低。

②在蒸餾時,蒸汽發生要均勻充足,蒸餾過程中不得停火斷汽,否則將發生倒吸。

③加堿要足量,操作要迅速;漏斗應采用水封措施,以免氨由此逸出損失。

三、氨基酸的測定——電位滴定法

1、原理

氨基酸具有酸性基團—COOH和堿性基團—NH₂,利用氨基酸的兩性作用,加入甲醛以固定氨基的堿性,使羧基顯示出酸性,將酸度計的玻璃電極及甘汞電極同時插入被測液中構成電池,用氫氧化鈉標準溶液滴定,依據酸度計指示的pH值判斷和控制滴定終點。

2、儀器

①酸度計。

②磁力攪拌器。

③微量滴定管(10mL)。

3、試劑

①36%中性甲醛溶液。

②氫氧化鈉標準溶液[c(NaOH)=0.0500mol/L]。

4、操作方法

吸取含氨基酸約20mg的試樣溶液于10mL容量瓶中,加水定容,混勻后吸取20.0mL,置于200mL燒杯中,加水60mL,插入酸度計的指示電極和參比電極,開動磁力攪拌器,用氫氧化鈉標準溶液(0.0500mol/L)滴定至酸度計指示pH=8.2,記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL),供計算總酸度含量。

加入10.0mL甲醛溶液,混勻,再用上述氫氧化鈉標準溶液繼續滴定至pH=8.2,記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積(mL)。

同時取80mL蒸餾水置于另一200mL潔凈燒杯中,先用氫氧化鈉標準溶液滴定至pH=8.2,此時不計標準堿溶液消耗量,再加入10.00mL中性甲醛溶液(36%),用氫氧化鈉標準溶液(0.0500mol/L)滴定至pH=8.2,作為試劑空白試驗。

5、計算

式中    w——試樣中氨基酸態氮的質量分數,%;

           c——氫氧化鈉標準溶液的濃度,mol/L;

           V1——滴定至終點(pH=8.2)時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,mL;

           Vo——空白試驗滴定至終點(pH=8.2)時消耗氫氧化鈉標準溶液的體積,mL;

           m——測定用試樣溶液相當于試樣的質量,g;

           0.014——1mL氫氧化鈉標準溶液[c(NaOH)=0.0500mol/L]相當于氮的質量,g。

6、說明及注意事項

①本方法為《醬油衛生標準的分析方法》(GB/T5009.39-1996)中規定的氨基酸態氮的測定方法。本方法準確快速,可適用于各類食品氨基酸態氮含量的測定。

②對于渾濁和色深樣液可不經處理而直接測定。

③36%甲醛試劑應避光存放,不含有聚合物(無沉淀)。

④試樣中如含有銨鹽會影響氨基酸態氮的測定,可使氨基酸態氮測定結果偏高。因此要同時測定銨鹽,將氨基酸態氮的結果減去銨鹽的結果比較準確。