食品中霉菌檢測方法探究

　　[摘 要] 目的：研究食品中霉菌的檢測方法。方法：采用不同的培養基、不同的接種方法對食品中的霉菌進行檢測。結果：孟加拉紅培養基和傾注法更適合進行食品中霉菌的計數。 
　　霉菌廣泛分布于自然界中，同時由于其可形成各種微小的孢子，因而很容易污染食品。霉菌污染食品后不僅可造成腐敗變質，而且有些霉菌還可產生毒素，人畜因誤食霉菌毒素而中毒。霉菌毒素是霉菌產生的一種有毒的次生代謝產物，自從20世紀60年代發現強致癌的黃曲霉毒素以來，霉菌與霉菌毒素對食品的污染日益引起重視。我國在2011年頒布了國家標準GB2761-2011《食品中真菌毒素限量》，各級食品監督檢測機構全面開展霉菌的檢測工作。本文主要對日常食品中霉菌的檢驗方法及檢驗過程中遇到的幾個問題進行探討。 
　　一、檢驗方法的選擇 
　　國內現行有效的食品中霉菌的檢測方法有兩種：一種是GB4789.15-2010食品微生物學檢驗霉菌和酵母計數[1]；另外一種是食品中霉菌和酵母計數 PetrifilmTM測試片法[2]。這兩種方法主要區別如下： 
　　1. 樣品稀釋液的不同。測試片要求1%的蛋白胨水或者磷酸鹽緩沖液，而國標方法使用滅菌的蒸餾水即可。 
　　2. 相對于國標法，測試片法操作起來簡潔方便，不用對大量的培養皿進行滅菌，不用制備培養基，樣品稀釋后直接接種，省時快速。 
　　3. 測試片法所用的測試片價格比較昂貴。 
　　綜上所述，一般情況下我們還是選擇國標法。 
　　二、培養基的選擇 
　　培養基的選擇應根據實驗材料和檢驗目的來確定。目前國標方法中使用的培養基有：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、孟加拉紅培養基（RBC）。我們用這兩種培養基對相同樣品同時進行培養，有以下發現： 
　　1. 在培養基配制過程中， PDA培養基能完全溶解，但澄清度不夠；而RBC能完全溶解，溶解后清亮透明（見圖1）。RBC傾注后在較短的時間就會凝固，而PDA則需要更長的時間。 
　　2. 霉菌在PDA培養基與RBC培養基都生長良好，但由于PDA培養基有無法完全溶解的細小白色粒子，與白色的霉菌菌落在一起，常常會干擾我們對霉菌的計數；而RBC上生長的都是紅色菌落，而且無細小粒子的干擾，便于準確計數（見圖2）。 
　　三、接種方式 
　　常用的微生物接種方式主要有傾注法和平板涂布法。國標方法中采用傾注法，然而有實驗和報道證實[3]，霉菌計數采用涂布法更合適。日常檢驗中我們對傾注法和平板涂布法進行比較： 
　　1. 在操作上：傾注法要求將培養基溶化之后冷卻至45℃左右，手感不燙，再注入培養皿中，但在實際操作中，很難精準地控制培養基溫度。培養基溫度過高可能會使霉菌孢子受熱損傷甚至死亡，而等待培養基冷卻，會使霉菌稀釋液保持時間過長。如果培養基過度冷卻，便無法傾倒注入培養基中。所以在平時的檢驗過程中，一是注意樣品稀釋與培養基冷卻應同步進行；二是利用恒溫水浴讓培養基保持溫度，從而可以避免以上情況的發生。 
　　2. 涂布法培養所需的時間較短，培養出的霉菌菌落數較多，霉菌孢子、菌落形態特征發育完全，便于鑒定。這是因為絕大多數霉菌屬于好氧型，在培養基表面生長快，發育好，而混在培養基中發育會受到影響。 
　　3. 涂布法是先制備培養基，后接種，因而可以檢查培養基是否染上雜菌。 
　　4. 由于涂布法吸收量較少，操作比較麻煩，如果平板干燥效果不好，容易使霉菌生長蔓延。涂布過程必須均勻，否則不利于單個菌落生長。傾注法要求每個稀釋度吸取1mL，便于菌落的計數；采用涂布法，培養基通常表面涂0.1mL的量，對于霉菌菌落的計數就不夠準確；而如果涂布1mL的量，等待干燥的時間過長，有時也會出現無法完全干燥的現象，霉菌得不到更好的培養，也就無法準確計數。 
　　5. 在日常檢測中，通常采用涂布棒進行樣液的涂布，由于涂布棒會附著少量的樣液影響接種量。所以，我們在實踐中吸取一定量的樣液后，旋轉平板，讓樣液盡量均勻地布滿整個培養基，也能達到涂布的效果。同時發現在PDA培養基上樣液不容易流動分布，而RBC上的樣液經轉動平板，樣液較易均勻分布（見圖3）。 
　　四、培養溫度 
　　培養溫度按照國標規定，一般情況下都采用28℃±1℃培養。同時也發現在培養溫度低于25℃或高于30℃時會直接影響霉菌的生長。 
　　五、培養時間 
　　正常培養條件下，培養3～4天的菌落數與5～6天的基本相同，但菌種的特征不明顯。因此，如果只要作霉菌計數，培養3～4天已基本達到目的，但對于無菌落的，則需要培養更長的時間。曾經在檢驗過程中發現幾種霉菌生長特別快、菌絲很多，在培養后第二天就可計數 ，如再延長培養時間菌絲就會覆蓋整個平皿，無法準確計數。這類霉菌污染比較普遍，檢測這類樣品，應提早觀察記錄。如圖4，同樣的樣品在兩個RBC培養基上進行涂布接種，一個培養了2天，一個培養了5天。 
　　六、菌落計數 
　　霉菌菌落由孢子和菌絲組成，相當擴散。在直徑9cm的平皿里，菌落數稍多就相互交叉重疊，影響計數，但數量太少又會產生較大的誤差。因此，選擇適當的稀釋度計數是保證結果準確的關鍵環節之一。通常選擇產品標準最上限規定來選擇三個稀釋度，再按照國標的計數方法進行結果報告。對污染較重的樣品需要增加一個稀釋度，以便結果更為準確。 
　　七、結 語 
　　1. 如果被檢驗食品的數量很大時，建議采用測試片法，可以縮短檢驗時間，縮短整個檢驗周期。 
　　2. 涂布法與傾注法的選擇，在樣品量較多時，選擇傾注法可以提高效率，前提是要控制好培養基的溫度；而涂布法更適宜霉菌的鑒定，而且在涂布時必須要涂布均勻。 
　　3. 由于霉菌檢測所需的時間較長，中間必須進行多次觀察，因此在實驗前要做好實驗計劃，確定觀察記錄的時間。通常在培養24h后就應該進行觀察，對生長迅速的，菌絲很長的一類霉菌48h后就可計數。 
　　4. 霉菌孢子易在空氣中傳播，所以檢驗時應必須在霉菌實驗室進行，整個檢驗過程保持平靜，減少空氣流通；操作時動作要快、輕，特別是培養過程中，如果觀察時動作過大，早期生長出的霉菌孢子就會在培養基內擴散，形成新的菌落，導致結果不準確。 
　　5. 從霉菌接種開始時，應在操作臺旁打開兩塊滅菌平皿，待接種結束后，澆注培養基，和檢樣同時進行霉菌培養，對整個接種過程進行驗證，可發現在整個接種過程中是否受環境污染。 
　　6. 檢驗前應認真做好全面的消毒滅菌工作，檢驗后應第一時間將有霉菌的培養物高壓滅菌，以防進一步污染。 
　　[參考文獻] 
　　[1]中華人民共和國國家標準GB 4789.15-2010食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數[S]. 
　　[2]中華人民共和國國家標準SN/T 2566-2010食品中霉菌和酵母計數 PetrifilmTM測試片法[S]. 
　　[3]Matsuda，H. Comparative study of the spread plate and pour plate techniques in terms of colony forming units of fungi [J].Journal of Antibacterial Antifung Agent. 1995（23） 613-618.