首次通過Cas9對Rpe65基因的治療性修正

　　先天性黑蒙癥(Leber’s congenital amaurosis, LCA)，是發生最早、最嚴重的遺傳性視網膜病變, 出生時或出生后一年內雙眼錐桿細胞功能完全喪失，導致嬰幼兒先天性盲。先天性黑蒙癥占遺傳性視網膜病變的5%以上，是導致兒童先天性盲的主要疾病（占10%-20%），多呈常染色體隱性遺傳。

　　在引起先天性黑蒙癥的基因中，發生突變最多的是CEP290、GUCY2D、CRB1、RPE65等基因。特別是，約6%的先天性黑蒙癥病例是由RPE65基因突變引起的。

　　2017年12月，美國食品藥物管理局(FDA)批準了Spark公司AAV基因療法，這是一種一次性基因療法，通過AAV病毒載體，將正確的RPE65基因遞送到視網膜細胞，用于治療因雙拷貝RPE65基因突變所致視力喪失但保留有足夠數量的存活視網膜細胞的兒童和成人患者，恢復和改善視力，該療法售價高達85萬美元/年。

　　2019年1月，基因編輯大神張鋒創立的Editas Medicine公司發表研究稱，其開發的編號為EDIT-101的CRISPR/Cas9基因療法，可恢復Leber先天性黑蒙癥10型的視力。2019年7月25 日，Editas Medicine公司和艾爾建（Allergan）聯合宣布：正式啟動CRISPR療法AGN-151587 （EDIT-101）的I/II期臨床試驗。

　　然而，迄今為止，除了2017年12月獲得美國(FDA)批準的Spark公司的AAV基因療法外，還沒有發現針對先天性黑蒙癥的實質性治療或治愈方法。由于這項批準的基因治療方法不能完全糾正突變序列，且在使用AAV時，AAV的載物量有一定的限制(約4.8 kb)，因此，在基因治療領域，還存在著有待于更廣泛的臨床應用的需求。

　　2019年10月30日，韓國韓東國際大學（Handong Global University）和首爾國立大學醫學院的研究人員在Science Advances雜志發表了題為：CRISPR-Cas9–mediated therapeutic editing of Rpe65 ameliorates the disease phenotypes in a mouse model of Leber congenital amaurosis 的研究論文。

　　在該研究中，研究人員通過視網膜下注射攜帶CRISPR-Cas9和供體DNA的AAV病毒在rd12小鼠(人類先天性黑蒙癥模型)中對Rpe65中疾病相關的無義突變進行了CRISPR-Cas9介導的首次治療性校正，并改善了視網膜功能，為開發先天性黑蒙癥的治療提供了新的視角。

　　CRISPR-Cas9技術在短短五年內風靡全球實驗室, 成為了生物科學領域最炙手可熱的研究工具, 可分別通過同源定向修復(HDR)或非同源末端連接(NHEJ)導致基因插入或突變、刪除。雖然HDR的發生頻率普遍低于NHEJ，但HDR永久糾正致病突變的能力對于治療各種遺傳疾病具有巨大的潛力。

　　CRISPR-Cas9介導的Rpe65的體外編輯

　　為了使用CRISPR-Cas9技術來治療先天性黑蒙癥，研究人員首先使用了來自rd12小鼠的胚胎成纖維細胞(MEFs)來篩選針對Rpe65外顯子3的單導RNA (sgRNA)序列，并最終確定了一個優化的sgRNA序列TS4 sgRNA進一步研究，因為它可以在離提前終止密碼子最近的位點上產生雙鏈斷裂(DSB)，并導致高效的插入或刪除(indel)率。

　　使用雙AAV系統對Rpe65進行體內基因組編輯

　　為了評估CRISPR-Cas9介導的疾病模型中Rpe65無義突變編輯的治療效果，研究人員更改了TS4中的一個核苷酸以設計TS4 rd12 sgRNA，該序列與rd12小鼠中Rpe65外顯子3突變位點的序列完全匹配。將所有必需的編輯組件合并到兩個單獨的AAV中（AAV-SpCas9和AAV-TS4 rd12 sgRNA-Rpe65-供體，以下稱為AAV-TS4 rd12-供體），并使用雙AAV系統進行體內遞送。研究人員通過改變其濃度來優化AAV組分的比例，以獲得最大的基因組編輯結果，研究表明在視網膜下遞送比在視網膜遞送更有效，并且Cas9與sgRNA的比例對于優化編輯至關重要。

　　Rpe65校正的rd12小鼠視網膜功能恢復

　　為了研究HDR介導的Rpe65基因校正對rd12小鼠的治療效果，研究人員在視網膜下注射AAV后6周和7個月進行黑暗適應后進行了視網膜電圖檢查。AAV處理導致注射后6周視網膜色素上皮細胞中Rpe65表達的恢復。此外，AAV處理導致注射后7個月視網膜色素上皮細胞中Rpe65基因表達的增加。在視網膜電圖中，在視網膜下注射后6周，AAV處理的rd12小鼠在黑暗適應后，對亮刺激（0 dB）產生了明確的響應。初次注射后，電反應可維持7個月，并且視網膜電圖a波和b波分別恢復到了野生型小鼠的21.2±4.1%和39.8±3.2%。這些功能恢復伴隨著解剖學改變，其中HDR介導的Rpe65基因校正阻止了rd12視網膜外核層神經元細胞的丟失。

　　Rpe65特異性CRISPR-Cas9的全基因組脫靶分析

　　為了全局表征TS4 rd12 sgRNA 識別的潛在脫靶位點，研究人員使用rd12小鼠的基因組DNA 進行了Digenome-seq，這是全基因組的無偏脫檢測方法。該分析顯示了幾個潛在的脫靶位點。隨后，研究人員使用靶向深度測序驗證了前29個Digenome-seq潛在脫靶位點。在rd12小鼠的視網膜中，6個基因組位點被證實是TS4rd12 sgRNA的活性靶點，這些所有活躍的脫靶位點均位于內含子或基因間區域。在隨后的脫靶分析中，與TS4 rd12 sgRNA序列相差最多三個核苷酸的所有33個同源位點，在AAV處理的rd12小鼠的預測基因組位點上未觀察到有意義的indel突變。此外，在這些小鼠中7個月內沒有組織學擾動或腫瘤發生。

　　總的來說，該研究提供了一種基于CRISPR-Cas9的新方法來治療先天性黑蒙癥。該研究稱，以前的報道均未在眼科疾病動物模型中顯示體內HDR介導的校正。該研究的永久性基因組編輯治療方法可以單獨使用，也可以與基因治療或蛋白質治療一起使用，以治療先天性黑蒙癥。

　　論文鏈接：

　　https://advances.sciencemag.org/content/5/10/eaax1210