高容量載體中基因組DNA片段末端的分離(小載體PCR)

T4 噬菌體 DNA 連接酶 限制性內切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ 耐熱性 DNA 聚合酶 模板 DNA

擴增緩沖液 dNTP 溶液 乙醇 酚 氯仿 醋酸鈉 T4 DNA 連接緩沖液

瓊脂糖凝膠 核酸和寡核苷酸 寡核苷酸盒 帶過濾層吸頭 薄壁微量離心管 移液器 程控式 PCR 儀 水浴或冷卻裝置

一、材料

1. 緩沖液和溶液

10X 擴增緩沖液

dNTP 溶液（1 mmol/L，包括所有 4 種 dNTP ( pH 8.0；PCR 級)

乙醇

酚：氯仿（1:1, V/V）

醋酸鈉（3 mol/L, pH 5.2）

10X T4 DNA 連接緩沖液

2. 酶及其緩沖液

T4 噬菌體 DNA 連接酶

限制性內切核酸酶 PstⅠ或 NsiⅠ

耐熱性 DNA 聚合酶

3. 凝膠

瓊脂糖凝膠

核酸和寡核苷酸

寡核苷酸盒 [ 5.0 OD₂₆₀/ml (~8.5 μmol/L)]，用 TE ( pH 7.6) 溶解 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAGGGTTAGGTTCCTGC TACATCTCCAGCCT TGCA3'

寡核苷酸（接頭）引物 [ 5.0 OD₂₆₀/ml (~17 μmol/L) ], 用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。 5'CATGCTCGGTCGGGATAGGCACTGGTCTAGAG3'

序列特異性寡核苷酸（載體) 引物 [ 5.0 OD₂₆₀/ml (~17 μmol/L) ]。用 TE ( pH 7.6 ) 溶解。

模板 DNA: 重組 BAC、YAC 或黏粒 DNA

4. 專用設備

自動移液器用的帶過濾層吸頭

擴增用的薄壁微量離心管（0.5 ml)

陽性對照專用的移液器

儲存有擴增程序的程控式 PCR 儀

15℃ 水浴或冷卻裝置

二、方法

1. 用 PstⅠ或 NsiⅠ消化約 5 μg 模板 DNA。取一小份反應產物，進行瓊脂糖凝膠電泳，以確證所有的 DNA 都已經被酶解。

2. 用酚: 氯仿抽提混合液及標準的乙醇沉淀法回收 DNA，然后用 70% 的乙醇洗滌沉淀。將管子開口倒扣在一疊衛生紙巾上，使最后殘留的乙醇揮發，然后用 50 μl H₂O 溶解濕潤的 DNA 沉淀。

3. 在一個無菌的 0.5 ml 的微量離心管中，依次加入下列物質：10X T4 DNA 連接酶緩沖液 10 μl，消化后的 DNA 模板 20 μl，寡核苷酸盒子 5.0 OD₂₆₀/ml 2 μl，T4 噬菌體 DNA 連接酶 5 Weiss 單位/μl 2 μl，加水至 100 μl。

設 3 個對照管，對照管的體系參照上述配方。其中一個無模板 DNA，另一個無寡核苷酸接頭，第 3 個無 T4 DNA 連接酶。

4. 將實驗管及對照管在 15℃ 下連接 12~16 h。

5. 在一個無菌的 0.5 ml 的微量離心管中，依次加入下列物質：10X 擴增緩沖液 2 μl，1 mmol/L 4 種 dNTP 混合溶液（pH 7.0） 2 μl，接頭的寡核苷酸引物 5.0 OD₂₆₀/ml 1 μl，載體的寡核苷酸引物 5.0 OD₂₆₀/ml 1 μl，取自步驟 4 的實驗管 DNA 連接產物 1 μl，耐熱 DNA 聚合酶 5.0 單位/μl 0.5 μl，加水至 20 μl。

設 3 個 PCR 對照。每只對照管中含有連接反應中相對應的對照反應液 1 μl。

6. 如果 PCR 儀沒有高溫頂殼，在反應混合體系里加一滴（約 50 μl）輕礦物油，以防止加熱和冷卻循環時樣品的蒸發。另外，如果用熱啟動則加一滴石蠟。

7. 將 PCR 管放入 PCR 儀中，按下表輸入程序后，開始擴增。



8. 將每一管擴增產物都取出一份（25%)，用瓊脂糖凝膠電泳分析。