「 色譜填料孔徑對多肽分離純化的影響 」
除了體積排阻色譜外，其它色譜分離機理都離不開樣品與色譜填料表面的作用。
色譜填料孔徑大小、分布及比表面積對多肽分離性能也有重大的影響，對于分子量小于1000的多肽樣品，一般選擇孔徑在100? 以下的就可以。
對于大多數分離模式來說有效的比表面積越大，載量越大，但有效比表面積取決于目標樣品的分子量、孔徑大小及孔容積。
這里指的有效比表面積是針對特定物質分離條件下有用的孔道比表面積總和，無效的比表面積是指孔徑小于一定尺寸，目標分子不能進出，在分離過程這些小于一定尺寸的孔道所產生的比表面積不能起到分離作用，因此要根據分離的樣品的分子量來選擇合適孔徑的色譜填料。
如胰島素分子量大概在6000左右，如果使用C8反相硅膠色譜填料分離純化，一般選用粒徑10微米，孔徑100?左右的色譜填料；
如果選用孔徑小于80?的C8硅膠色譜填料，雖然測得該填料比表面積比孔徑100?色譜填料要大，但該色譜填料分辨率和載量會比100?色譜填料低很多；
如果選擇孔徑過大的色譜填料，如200?的色譜填料，該填料比表面積比100?的相對會減小，導致載量降低，同時孔徑大的硅膠填料機械強度也比孔徑小的機械強度要差。
對于聚合物色譜填料需要的孔徑會比硅膠要大，一般300?聚合物色譜填料就相當于100?硅膠色譜填料。
如果孔徑保持一致條件下，孔容積越大，比表面積也越大，單位體積的硅膠含量越少，因此機械強度則越差。
在其它條件不變，一般選擇有效比表面積越大的填料越好，這樣載量大，機械強度好。一般來說孔容積越大載量越大，分離效果也越好，但孔容積越大，機械強度越差。因此對于一般多肽分析和分離用色譜填料孔容積要求在0.5-1.0ml/g左右，如果用于體積排阻利用分子篩性質的填料孔容積要求會大于1.3ml/g。
另外小于50?的微孔的存在對部分樣品組分的分離效果有影響，因此在做硅膠表面鍵合之前最好把這些微孔封掉。
常規色譜填料粒徑大小分別有1.7、3、5、8、10、12、15、20、30、40、50微米；常規孔徑可選擇0.05nm（50?）、0.1nm（100?）、0.12nm （120?）、0.17nm （200?）、0.3nm （300?）、0.1nm（500?）。因此要根據目標多肽樣品的分子量選擇合適孔徑色譜填料。
03
「 填料粒徑大小及均一性對多肽分離純化的影響 」
色譜填料的粒徑主要影響填充柱的的柱效和背壓。填料粒徑越小，填充柱的柱效越高，在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度。填料粒徑越小，柱壓也越高，因此對色譜系統的要求也越高，設備投資也越大，小粒徑色譜填料的價格也高。
因此用于工業制備的色譜填料顆粒粒徑往往在10微米以上, 常規HPLC色譜柱硅膠填料粒徑在3-5微米之間, 而用于UPLC 的色譜填料在2微米以下。
選擇色譜粒徑大小要綜合考慮分離效率和成本。下圖是用納微科技UniPS系列不同粒徑聚合物色譜填料（粒徑分別為10、20、30微米）對多肽、蛋白等分離效果的影響。
不同粒徑的色譜填料對多肽和蛋白質分離效果的對比
除了粒徑的大小外，色譜填料的粒徑分布情況也是色譜填料性能的重要參數。在高效液相色譜分離過程中，流動相流過的通路主要是粒狀填料間的間隙，而填料粒徑大小、均一性及填充柱床緊密程度的不均一性，都會使填充柱產生多路徑效應。
使溶質分子在填充柱床中的流動路徑和保留時間發生變化，導致色譜峰變寬，從而影響溶質分子分離效果。
當色譜微球填料粒徑分布較寬，相同的溶質分子流過色譜柱時，在填充柱床內產生不同的通路，導致經過的路徑長短不同，相應的保留時間也有所不同，使色譜峰展寬，理論塔板數變小，柱效降低。
當使用粒徑均一的微球填料填充色譜柱時，因其緊密程度一致，有效減少了填充床的多路徑效應，使溶質分子流過色譜柱時經歷的路徑長度基本相同，相應的保留時間也較一致，使色譜峰寬變窄，理論塔板數升高，從而獲得較高的柱效（粒徑均一性對分離柱效的影響如圖8所示），在小分子及多肽的反相分離中獲得較好的分離效果。
粒徑均一性對分離柱效的影響
用于多肽藥物分離純化的色譜填料要求極高，因此制備技術壁壘高，世界上真正具備規模化生產能滿足色譜需求的多分散多孔球形硅膠的廠家只有Kromasil, Daisol，Fuji及Merck等四家。
而可以生產聚合物色譜填料的廠家主要有美國GE，日本Tosoh 等少數公司。目前大多數市場上的色譜填料無論是硅膠基質還是聚合物基質粒徑分布都較寬，因此開發單分散色譜填料的技術一直是業界的發展目標，也是該領域的技術難題。
納微科技致力于研究單分散微球材料的制備和應用的高科技企業，不僅成功地開發出單分散多孔聚合物微球，而且成為世界第一家開發出單分散硅膠填料的大規模生產技術，并獲得國家發明ZL。
先進微球材料是多肽藥物發展的基礎，無論是用于多肽固相合成的微球載體還是用于分離純化和檢測的色譜填料都離不開高性能微球材料，微球材料制備技術的進步會促進多肽藥物產業的發展。
蘇州納微科技股份有限公司（簡稱納微）專門從事高精度、高性能和高附加值微球材料研發和生產的國家高新技術企業，致力于建設世界領先的納微米球精準制備和應用平臺，是世界上能提供最多微球品種與規格的公司之一。
納微擁有單分散色譜填料的精準制備技術、表面功能化技術和規模化生產能力；產品涵蓋硅膠正相、反相、HILIC、手性填料，聚合物反相、離子交換、疏水層析、親和層析（ProteinA、金屬螯合、苯硼酸）、固相萃取、凝膠滲透色譜及特殊功能填料；還提供色譜柱、磁珠、標準顆粒、分析檢測、分離純化實驗技能培訓及分離純化整體解決方案。納微已實現大規模出口高性能色譜填料到歐、美、日、韓等國家和地區的國際知名制藥和色譜企業，成為世界色譜行業的領軍企業之一。
納微承擔國家戰略性新興產業發展專項（2013年蛋白類生物藥和疫苗發展專項）、國家科技支撐計劃項目課題，建成江蘇省納微米球材料工程中心及工程技術研究中心，成立蘇州納微先進微球材料應用技術研究所，已獲得國家發明ZL19項，獲1項國家重點新產品和4項江蘇省高新技術產品。