高效毛細管電泳法測定注射用頭孢他啶的含量

目的用HPCE測定注射用頭孢他啶的含量。方法高效毛細管電泳法，有效毛細管長度60cm×內徑75μm；硼砂緩沖液25mmol/L (pH8．2)，高壓進樣5s，分離電壓20KV，溫度為25℃，檢測波長為254nm，頭孢曲松為內標。結果頭孢他啶在4～20μg/ml 濃度范圍內線性關系良好(r=0．999 7)，平均回收率為98．96％(n=5，RSD =1．74％)。結論本法簡單、快捷、靈敏。
[關鍵詞]頭孢他啶；高效毛細管電泳法
    頭孢他啶屬第三代頭孢類抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌作用強的特點。對多種β-內酰胺酶有抵抗力，臨床廣泛應用于各種單純及混合感染。目前測定頭孢他啶含量較成熟的方法有HPLC法。高效毛細管電泳(HPCE)是近年來發展迅速的一種新的分離分析技術。與傳統的分離分析手段相比較，具有高效、快速、微量和易于自動化等優勢。HPCE分析抗生素的研究正引起人們的關注。高效毛細管電泳測定頭孢他啶的含量國內未見報道。本文建立了用HPCE法測定頭孢他啶含量的方法，此方法采用內標法測定簡便靈敏、結果可靠，重現性好，能滿足頭孢他啶的藥品質量監控。
1 儀器與試藥
    高效毛細管電泳儀，石英毛細管柱(60cm×75／μm)(均為美國Waters公司產品)；Milennimn32數據處理系統；頭孢他啶標準品(中國藥品生物制品檢定所)；頭孢曲松標準品(中國藥品生物制品檢定所)；注射用頭孢他啶(廣州白云山制藥股份有限公司，批號030407、030414、030509、030520、030605)；硼砂、氫氧化鈉均為分析純。
2 方法與結果
2．1 緩沖液的配制 精密稱取4．78g硼砂溶于500ml水中，配成25mmol/L 硼砂電泳緩沖液溶液，磷酸調DH為8．2。
2．2 電泳操作條件分離電壓：20KV；檢測波長：254nm；進樣量：50kPa×5s；緩沖液：25mmol/L 硼砂溶液(pH8．2)。每次進樣前用緩沖液沖洗毛細管柱10rain，每次分析后用0．1mol/L 的氫氧化鈉溶液沖洗2min，水沖洗10min。所用溶液均經0．45μm濾膜濾過。上述電泳條件，得電泳圖。
2．3 標準品溶液和內標溶液的配制 精密稱取頭孢他啶標準品10．0mg，置于100ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，配成0．1mg/ml 的頭孢他啶標準品溶液。精密稱取頭孢曲松標準品20．0rng置于100ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。吸取上述溶液5ml置25ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成頭孢曲松40μg?/ml 的內標溶液。
2．4 線性關系考察 精密吸取頭孢他啶標準品溶液2、4、6、8、l0ml置于50ml量瓶中，分別加內標溶液5ml，用水稀釋至刻度，搖勻，按上述電泳條件，分別進樣5s，以標準品濃度(μg/ml )為橫坐標(C)，頭孢他啶主峰面積與內標峰面積比為縱坐標(A)作圖，回歸方程為：A=0．248 C 一0．078，r =0．999 7，n =5頭孢他啶在4～20μg/ml 濃度范圍內線性關系良好。
2．5 精密度試驗 精密吸取頭孢他啶標準品溶液2ml和內標溶液5ml置于50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。按上述電泳條件，重復進樣5次，測得頭孢他啶峰面積的RSD為1．82％ ，表明儀器精密度良好。
2．6 穩定性試驗 將同一標準品溶液在相同電泳條件下，分別于0、1、2、3、4h重復進樣5次，測得頭孢他啶峰面積的RSD為1．89％ ，表明頭孢他啶在4h內測定結果穩定。
2．7 重復性試驗 按樣品測定項下方法，對同一批號樣品，分別取樣平行測定5次，求得含量的相對標準偏差RSD為2．01％ ，表明重復性較好。
2．8 加樣回收率試驗 按照2．4項的方法配制10、20、30μg?ml 三個已知濃度的樣品與內標的混合溶液，加入頭孢他啶標準品溶液進行測定，以頭孢他啶峰面積與內標峰面積比代入回歸方程計算回收率。
2．9 樣品測定 取注射用頭孢他啶5批，精密稱取適量置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻。精密吸取該溶液lml置于25ml量瓶中，加入內標溶液2ml，用超純水稀釋至刻度，搖勻。進樣，內標法計算5批樣品的含量并與I-IPLC法測定的結果相比較，結果表明兩種方法測定的結果之間無顯著性差異。
3 討論
3．1 由于頭孢他啶溶液呈酸性，宜選用堿性緩沖液。本實驗在對不同緩沖液進行的實驗中，發現硼砂對頭孢他啶的分離最理想。研究表明緩沖液濃度和pH值對分離具有重要影響。高濃度緩沖液可獲得較好的分離，但保留時間會變長，而且，導致通過毛細管的電流增加，從而增大焦耳熱。因此，我們選用25mmol/L 硼砂作緩沖液。pH值選擇是決定分離成敗的關鍵。采用pH8．2的硼砂緩沖液時分析時間短，峰形尖銳、對稱并達到基線分離。
3．2 研究表明，柱溫降低分離度變好，但柱效降低，分析時間變長。綜合考慮分離度和遷移行為的變化，本實驗選用25℃柱溫較合適。分離電壓是毛細管電泳的一項重要參數，實驗表明，增加組分的遷移速度是減少譜帶展寬、提高分離效率的重要途徑，增加電場強度可以達到提高速度的目的。但高場強度導致通過毛細管的電流增加，從而增大焦耳熱。在20KV時，分離選擇性最佳。
3．3 由于吡啶是頭孢他啶合成過程的原敷料，又是降解過程中的降解產物，對人體有一定的毒副作用。因此，在測定中一定要注意低溫和避光保存，以防其分解。
3．4 本實驗對HPLC和HPCE的測定結果進行了比較，兩種方法測定的結果無顯著性差異。HPLC法與HPCE法相比，具有消耗成本高、分析時間長、有機溶劑用量大等缺點。我們利用高效毛細管電泳法測定頭孢他啶的含量，方法簡便、準確、快速、重復性好，可為頭孢他啶的質量控制提供一種簡便的方法。