反相色譜（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶質、極性流動相和非極性固定相表面間的疏水效應建立的一種色譜模式，任何一種有機分子的結構中都有非極性的疏水部分，這部分越大，一般保留值越高，在高效液相色譜中這是應用面最廣的一種分離模式，在生物大分子的反相液相色譜條件下，流動相多采用酸性的、低離子強度的水溶液，并加一定比例的能與水互溶的異丙醇、乙腈或甲醇等有機改性劑，大量使用的填料為孔徑在30納米以上的硅膠烷基鍵合相，除此之外，也有少量高聚物微球。實驗表明，烷基鏈長對蛋白質的反相保留沒有顯著的影響，但在蛋白質的活性回收上短鏈烴基（如C4，C8，苯基）和長鏈烷基（如C18，C22）反相填料是有區別的。表現在烷基鏈越長，固定相的疏水性越強，因而為使蛋白質較快洗脫下來，需要增加流動相的有機成分。過強的疏水性和過多的有機溶劑會導致蛋白質的不可逆吸附和生物活性的損失。總起來說，在烷基鍵合硅膠上的反相色譜，由于其柱效高、分離度好、保留機制清楚，是蛋白質的分離、分析、純化和結構闡明廣泛使用的一種方法。
由于在反相色譜中，使用了乙腈、甲醇等價格高且有一定毒性的試劑，在一定程度上使該方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，該方法用在分析鑒定方面更多一些，特別是對有機溶劑具有耐受性的樣品。例如多肽樣品，可用HPRPC對合成的肽huBPP進行分析。
（一）實驗目的
用HPRPC對huBPP進行純度鑒定。
（二）材料和試劑
1，儀器：高效液相色譜儀，Beckman公司gold system.
2，色譜柱：⑴ 名稱：Diamonsil TM（鉆石） C18柱，5цm
⑵ 規格：250×4.6mm
3，試劑：甲醇（HPLC級）、三氟己酸（TFA）、乙腈 （HPLC級）、雙蒸水
（三）樣品準備
取待分析的huBPP，稱量，用0.1%的TFA液溶解，配制成濃度大于1mg/ml的液體。必要時過濾或離心。
（四）操作
1、液體準備：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脫氣。
2、開機
3、上柱
4、輸入參數
檢測波長 245nm
流速 1ml/min
流動相： A液：0.1%TFA
B液：99.9%乙腈-0.1%TFA
洗脫條件：0-100% B 20min
5、平衡色譜柱 一般反相柱都保存在甲醇中，應置換出甲醇，用A液平衡色譜柱，待基線平穩后準備上樣。必要時，可按洗脫條件不上樣運行一遍程序，以洗出色譜柱可能存在的雜質。
6、上樣，取20цl樣，注入上樣閥，將閥門扳下，即上樣。
7、進行分離，鑒定。
8、打印結果，并分析，可得到峰數，峰高，面積百分比，保留時間等參數。
9、用B液洗柱5min，若不再使用時，換成甲醇，洗滌后保存。