高效液相色譜儀原理及操作步驟

1. 高效液相色譜儀原理
高效液相色譜儀原理 高效液相色譜儀的使用和原理分析
高效液相色譜法（HPLC）是目前應用廣泛的分離、分析、純化有機化合物（包括能通過化學反應轉變為有機化合物的無機物）的有效方法之一。

在已知的有機化合物中，約有80%能用高效液相色譜法分離、分析，而且由于此法條件溫和，不破壞樣品，因此特別適合高沸點、難氣化揮發、熱穩定性差的有機化合物和生命物質。HPLC系統一般由輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、數據記錄及處理裝置等組成。

其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關鍵部位。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機、自動進樣器、與柱或保護住、柱溫控制器等，現代HPLC儀還有微機控制系統，進行自動化儀器控制和數據處理。

制備型HPLC儀還備有自動餾分收集裝置。目前常見的HPLC儀生產廠家國外有Waters 公司、Agilent 公司（原HP公司）、島津公司等，國內有上海伍豐科學儀器有限公司，上海禾工科學儀器有限公司，大連依利特公司、北京創新通恒、北京溫分等。

一、輸液泵1.泵的構造和性能輸液泵是HPLC系統中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個質量和分析結果的可靠性。

輸液泵應具備如下性能：①流量穩定，其RSD應小于0.5%，這關系到定性定量的準確性；②流量范圍寬，分析型應在0.1~10ml/min范圍內連續調，制備型應能達到100ml/min；③輸出壓力高，一般應能達到150~300KG/CM2：④液缸容積小；⑤密封性能好，耐腐蝕。泵的種類很多，按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵。

恒流泵按結構又可分為螺旋注射泵、柱塞往復泵和隔往復泵。恒壓泵受柱陰影響，流量不穩定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵己被淘汰目前應用最多的是柱塞往復泵。

柱塞往復泵的液缸容積小，可至0.1ml，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環和梯度洗脫；改變電機轉速能方便地調節流量，流量不受柱壓影響；泵壓可達400KG/CM2。ADW主要缺點是輸出的脈沖性較大，現多彩采用雙泵系統來克服。

雙泵按連接方式可分為并聯式和串聯式，一般說來并聯泵的流量重現性較好（RSD為0.1%左右，串聯泵為0.2~0.3%），但出現故障的機會較多（因多了單向閥），價格也較貴。二、進樣器一般HPLC分析常用六通進樣閥（以美國RHEODYNE公司的7725和7725I型最常見），其關鍵部件由圓形密封墊子（轉子）和固定底座（定子）組成。

耐高壓（35~40MPA），進樣量準確，重復性好（0.5%），操作方便。六通閥進樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。

①用部分裝液法進樣時，進樣量應不大于定量環體積的50%（最多75%），并要求每次進樣體積準確、相同。此法進樣的準確度和重復性決定于注器取樣的熟練程度，而且易產生由進樣引起的峰展寬。

②用完全裝液法進樣時，進樣量應不小于定量環體積的5~10倍9最少3倍，這樣才能完全置換定量環內和流動相，消除管壁效應，確保進樣的準確度及重復性。三、色譜柱色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔負分離作用的色譜柱是色譜系統的心臟。

對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于HPLC的各種微粒填料好多孔硅膠以及以硅膠為基質的鍵合相、氧化鋁、有機聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為3,5,7,10UM等，柱效理論值可達5~16萬/米。

對于一般的分析只需5000塔板數的柱效；對于同系物分析，只要500即可；對于較難的分離物質對則可采用高達2萬的柱子，因此一般10~30CM左右的柱長就能滿足復雜混合物分析的需要。柱效受柱內外因素影響，為使色譜柱達到最佳效率，除柱外死體積要小外，不要有合理的柱結構（盡可能減少填充床以外的死體積）及裝填技術。

即使最好的裝填技術，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情況總是不一樣的，靠近管壁的部位比較疏松，易產生溝流，流速較快，影響沖洗劑的流形，使譜帶加寬，這就是管壁效應。這種管壁區大約是從管壁向內算起30倍料徑的厚度。

在一般的液相色譜系統中，柱外效應對柱效的影響遠遠大于管壁效應。四、檢測器HPLC的檢測器分為兩類：通用型檢測器和專用型檢測器。

1.通用型檢測器可連續測量色譜柱的流出物的全部特性變化，通常采用差分測量法，這類檢測器包括示差折光檢測器、介電常數檢測器、電導檢測器等，通用檢測器適用范圍廣，但由于對流動相有響應，因此易受溫度變化、流動相和組分的變化的影響，噪聲和漂移都比較大，靈敏度較低，不能用梯度洗脫。2.專用型檢測器用以測量被分離樣品組分某種特性的變化。

這類檢測器對樣品中組分的某種物理或化學性質敏感，而這一性質是流動相所不具備的，或至少在操作條件下不顯示。這類檢測器包括紫外檢測器、熒光檢測器、放射性檢測器等。
高效液相色譜儀的工作原理？
高效液相色譜儀工作原理；高壓泵將貯液罐的流動相經進樣器送入色譜柱中，然后從檢測器的出口流出，這時整個系統就被流動相充滿。當欲分離樣品從進樣器進入時，流經進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，分離后不同組分依先后順序進入檢測器，記錄儀將進入檢測器的信號記錄下來，得到液相色譜圖。

高效液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送，色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬），同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。