系統由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統，樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數，液相色譜在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附-解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數據以圖譜形式打印出來。
一般采用隔膜注射進樣器或高壓進樣間完成進樣操作，進樣量是恒定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
液相色譜包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為1.47～4.4x10Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高分辨率、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存器和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、PH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
液相色譜該系統包括色譜柱、連接管和恒溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料制成，住內裝有直徑為5～10靘粒度的固定相（由基質和固定液構成）。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基因基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械涂漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），液相色譜或者用化學法偶聯各種基因（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、致密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高分辨率是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高分辨率的道理。
檢測系統用于連續檢測色譜柱流出的物質，進行定性定量分析。要求其靈敏度高、噪音小、基線穩定、響應值的線性范圍寬等。近年來各國都在研究開發新的檢測技術，進一步擴大了HPLC的應用。根據檢測需要的不同檢測器可分為紫外檢測器（UVD）、示差折光檢測器（RID）、電化學檢測器（ECD）、紅外檢測器（IRD）、核磁共振檢測器（NMRD）、質譜檢測器（MSD）、蒸發光散射檢測器（ELSD）、小角度激光散射檢測器（LALLSPD）。
高效液相色譜的分析結果除可用記錄儀繪制譜圖外，還可使用微處理機和色譜數據工作站來記錄和處理色譜分析的數據。