高效液相色譜儀的應用遠遠大于氣相色譜儀。它廣泛用于合成化學、石油化學、生命科學、臨床化學、藥物研究、環境監測、食品檢驗及法學檢驗等領域。
1 在食品分析中的應用
①食品營養成分分析：蛋白質、氨基酸、糖類、色素、維生素、香料、有機酸（鄰苯二甲酸、檸檬酸、蘋果酸等）、有機胺、礦物質等。
②食品添加劑分析：甜味劑、防腐劑、著色劑（合成色素如檸檬黃、莧菜紅、靛藍、胭脂紅、日落黃、亮藍等）、抗氧化劑等。
③食品污染物分析：霉菌毒素（黃曲霉毒素、黃桿菌毒素、大腸桿菌毒素等）、為了元素、多環芳烴等。
2 在環境分析中的應用
多環芳烴（特別是稠環芳烴）、農藥（如氨基甲酸酯類，反相色譜）殘留等。
3 在生命科學中的應用
HPLC技術目前已成為生物化學家喝醫學家在分子水平上研究生命科學、遺傳工程、臨床化學、分子生物學等必不可少的公開。其在生化領域中的應用主要集中于兩個方面。
a低分子量物質，如氨基酸、有機酸、有機胺、類固醇、卟啉、糖類、維生素等的分離和測定。
b該分子量物質，如多肽、核糖核酸、蛋白質和酶的純化、分離和測定。
4 在醫學檢驗中的應用
主要應用于體液中代謝物測定、藥代動力學研究及臨床藥物檢測。
a 合成藥物：抗生素、抗抑郁藥物（冬眠靈、氯丙咪嗪、安定、利眠寧、苯巴比妥等）、磺胺類藥等。
b 天然藥物：生物堿如吲哚堿、顛茄堿、鴉片堿、強心苷等。
5 在無機分析中的應用
包括陽離子、陰離子的分析等。