高通量、低成本SNP、突變或甲基化檢測方法—HRM技術應用

HRM 介紹

HRM 技術是high-resolution melting analysis 即高分辨熔解曲線分析技術，是近年國外興起的一種全新的突變掃描和基因分型的遺傳分析方法。基于高效穩健的PCR 技術，HRM 不受突變堿基位點與類型局限，無需序列特異性探針，在PCR 結束后直接運行高分辨熔解，即可完成對樣品突變、單核苷酸多態性-SNP、甲基化、HLA 配型等的分析。

因操作簡便快速，使用成本低，結果準確，實現了真正的閉管操作，HRM 技術受到普遍關注。

HRM 原理

HRM 的主要原理是根據DNA 序列的長度，GC 含量以及堿基互補性差異，應用高分辨率的熔解曲線對樣品進行分析，極高的溫度均一性和溫度分辨率使分辨精度達到對單個堿基差異的區分。隨著高精度PCR 儀（LightCycler? 480 和Rotor-Gene 6000 ）和飽和染料（LC Green 、Eva Green 等）的出現，HRM 技術的普及使用成為可能。

HRM 應用

 ? SNP（單核苷酸多態性）的篩查。

 ? 基因突變掃描，包括缺失、重復、點突變。

 ? 新突變的篩查。

 ? 甲基化的篩查。

 ? 遺傳育種中特定突變的篩查、未知突變的發現。

 ? HLA 基因組配型、等位基因頻率分析、物種鑒定、品種鑒定、甲基化研究。

 ? 法醫學鑒定、親子鑒定。

 ? 動植物品質相關多態性位點的研究等。植物抗逆性，突變與性狀關聯性研究。

HRM 特點

 ? 高通量：1 次可同時檢測10-384 樣本，適合大樣本、多SNP、多突變位點及多位點甲基化的掃描。

 ? 高敏度：腫瘤研究中低突變率樣品基因突變檢測，最低檢測到0.1%的突變樣品基因突變，即檢測到1000 個正常細胞中1 個突變細胞，適用于手術和其它微量組織中突變檢測。檢測靈敏性遠高于“PCR+ 測序”的25% ，即100 個正常細胞中至少有25 個突變細胞，測序僅適用手術組織。

 ? 特異性好：PCR 產物無需后續處理，特異性高達100% 。直接未知雜合突變鑒定準確性100%，特異性100% 。直接未知純合突變鑒定準確性96%， 利用非標記探針快速基因分型法直接未知純合子鑒定準確性100%。

 ? 重復性好：重復性100% 

 ? 使用范圍廣：不受堿基位點局限，除可檢出已知突變外，也能檢測出未知突變。

 ? 重復性好：樣品PCR 和HRM 分析直接在同一管內進行，實現閉管操作，避免交叉污染。

 ? 操作簡便：只需設計特異引物，無需序列特異性探針，無需測序，也不受突變堿基位點與類型的局限。

 ? 成本低：簡化操作時間和步驟，大大降低成本，檢測費用遠少于測序、Taqman 探針技術。

 ? 標本范圍廣：可用于新鮮或酒精固定、石蠟包埋的手術標本，也可用于微量的穿刺或活檢標本、血液標本、糞便標本等非手術標本的檢測。傳統“PCR+ 測序”方法難以檢測大部分不能手術的患者。

 ? 其它：只檢測PCR 樣品中熒光強度的變化，不消耗任何PCR 樣品，無污染，PCR 產物可以進行下游分析，非常適合于測序前的SNP、甲基化等預掃描篩查。