干細胞研究鼻祖分享經驗：如何分選干細胞

　　最早研究人員是在1997年發現了急性髓系白血病（AML）血液樣品中的癌癥干細胞，但是由于采用表面標記物證明實體腫瘤中癌癥干細胞的存在，常常會出現不一致的結果，因此這一理論也引發了激烈的討論。但是近年來科學家們在所有癌癥類型（膠質母細胞瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌和肺癌）中發現了具有自我更新能力，啟動腫瘤發生的細胞，因此討論不再圍繞著“癌癥干細胞是否存在？”了，而是變成了“癌癥干細胞的類型有多少種？”

　　要想了解癌癥干細胞并不容易，其中一大阻礙就是癌癥干細胞的獲得，許多醫院會對腫瘤樣品進行冷凍切片，而要從解凍組織中獲得可用的細胞就沒有從新鮮樣品中取樣那么簡單了。另外一個問題在于根據細胞表面標記分離高純度的細胞群。近期The Scientist雜志找到了一些專家，請教了他們在這些方面的經驗。

　　通過流式細胞儀分選干細胞

　　斯坦福大學的干細胞生物學與再生醫學研究院主任Irving L. Weissma教授是世界頂級的生物醫藥科學家，免疫學、癌生物學、干細胞、腫瘤免疫和細胞治療等領域的權威，美國國家科學院和國家醫科院兩院院士，文理科學院院士。他曾在世界上最早發現、分離和純化造血干細胞，并成功用于癌的細胞移植治療，被譽為“干細胞科學的鼻祖”。

　　癌癥干細胞通常是通過細胞表面的標記物進行識別，并利用熒光共軛的抗體進行染色（現下設計出了靶向不同標記物的不同顏色熒光試劑），這樣流式細胞儀就能從懸浮液中檢測到這些熒光細胞。雖然目前許多染色指南采用的是單克隆抗體，但是一些小心的研究人員還會加上一個封閉步驟，用以阻止抗體識別出假陽性。

　　Weissma教授建議道，僅僅采用一種標記物分離AML干細胞并不夠，這個由正常造血干細胞分化成AML癌細胞的過程我們了解的比較多了，因此應該進行最具特異性的標記進行分離。Weissma教授建議從AML干細胞群中要分離出CD34+，CD38-，CD90+，和Lin-細胞群。

　　對于實體腫瘤，專家則指出研究人員需要先對目標癌癥的干細胞文獻非常了解熟悉，雖然研究已經發現Lgr5 能標記結腸癌腫瘤干細胞，但細胞表面的Lgr5 表達一般較低，其它的標記，如EpCAM、CD44和CD166也已由多項實驗證實，可以用于癌癥干細胞分離（PNAS, 104:10158-63, 2007； J Clin Pathol, 65:140-45, 2012； Oncol Lett, 7:1544-48, 2014）。

　　來自斯坦福大學的Michael Clarke是首位從實體腫瘤中分離出癌癥干細胞的科學家，他警告說雖然細胞表面的標記物可富集，但是這些標記物并不能確保分選出來的細胞就會發展成一個完整腫瘤——驗證癌癥干細胞的關鍵一步。由于實體腫瘤的癌癥干細胞標記差異很大，因此研究人員需要通過移植實驗對單個腫瘤的所有細胞類型進行檢測。

　　“對于大多數人來說最棘手的就是分選，”Dove說，“流式細胞儀操作并不便宜，也不容易，研究人員如果沒有經驗就需要摸索各種閾值，校準和參數。而且更重要的是，利用抗體分離癌癥干細胞會由于發射光譜重疊而造成紊亂，研究人員應該仔細分析實驗中采用的每種單克隆抗體的用量，比較不同的熒光基團抗體組合效果，換句話說，這就是一個費時費力的優化過程。