2014年測序、克隆、細胞分析等技術展望

　　新一代測序

　　新一代測序(NGS)技術一路走來，逐漸褪下其神秘面紗，進入越來越多的實驗室。隨著時間的推移，NGS系統從“高端大氣上檔次”的大型平臺演化成滿足個性化需求的臺式測序儀。MiSeq、Ion Torrent和454 GS Junior這些儀器的上市，也推動了測序平臺的普及。同時，MiSeqDx測序儀通過美國FDA認證，成為行業內一大里程碑事件，讓NGS的臨床應用成為現實。2014年，NGS技術將繼續發展，可能會為我們帶來更多驚喜。

　　1.納米孔測序走出陰影：Oxford Nanopore Technologies公司沉寂了一年之后，終于在11月底啟動MinION測序儀的早期試用計劃。2014年初，他們會將儀器發送給客戶。據稱，這個系統不需要文庫制備，成本極低，且讀長高達幾十kb。這究竟是炒作，還是事實?答案將在明年揭曉。屆時我們將看到許多有關納米孔測序儀的數據。

　　2.“黑客”改造測序儀：隨著使用的增加，研究人員對測序平臺更加得心應手。當然，這也使得他們不再滿足于現有的平臺，而是嘗試打開蓋子，調整機器，以滿足他們的個性化需求。之前，我們曾介紹過，麻省理工大學的高手曾成功調整Illumina測序儀，開展單個通道的測序。2014年，這方面的文章估計會越來越多。而這些調整也有望回到儀器開發者手中，納入未來的系統更新。

　　3.應用程序，應用程序，應用程序：你能想象沒有App Store的 iPhone 還會大受歡迎嗎?同理，沒有應用程序和實驗手冊的測序儀將變得不完整。從2013年開始，我們已經陸續看到有關拓展應用程序的文獻出現，我們預計整個 2014 年，開發者們將會想出 NGS 系統的新用途。

　　4. 新技術?測序技術當然不會停滯，新的方法和技術仍在不斷涌現。此前，一支研究小組在報道了在石墨烯納米帶上引入納米孔，這比目前的絕緣膜明顯更薄，有望提高納米孔檢測的速度和靈敏度。此外，單細胞測序也是一個研究熱點。近日，一個研究小組在《Nature Biotechnology》上發表文章，介紹了一種新的聚合酶克隆和測序策略，將來可用于單細胞多樣性的研究。

　　雖然備受矚目的基因組學Archon X獎已被取消，但基因組學研究不會停滯，測序技術仍將繼續發展。在未來的一年，我們期待更多讓人驚喜的創新。

　　RCR/克隆

　　PCR和克隆是我們十分熟悉的技術，熟悉到我們都有些陌生了，不清楚最新的進展。其實，方法開發者一直在努力擴大其用途，近年來也有一些讓人吃驚的結果。那么，這些經過時間考驗的技術又將會帶來一個怎樣的未來?也許會是更大、更快、更小。

　　1. 更大：你想要將一個DNA片段插入載體中?沒問題。那么兩個片段呢?好吧，難一點，但是也能做到。那五個怎么樣?如今我們正走入一個灰色地帶;這可能需要一些時間。隨著研究人員在合成生物學等領域的研究愈加深入，他們需要一些克隆方法，以一種簡單的方式插入多個DNA片段，比如不依賴于連接的克隆(LIC)或 Gibson拼接。

　　Gibson拼接是JCVI的Daniel Gibson在2009年發明的新方法。它利用核酸外切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶進行拼接，需要相鄰的具有重疊序列的DNA片段。核酸外切酶從5’ 端降解核苷酸，且不與DNA 聚合酶競爭。雙鏈DNA 被消化產生突出的單鏈DNA，重疊序列特異性退火，此時，外切酶逐漸熱失活。DNA聚合酶和DNA連接酶修復連接成完整的雙鏈 DNA分子，從而實現無痕拼接。這種技術非常高效，而我們有理由相信，2014年在大規模基因拼接上有更多改進。

　　2. 更快：PCR 需要時間。我們需要反復的變性、退火和延伸，才能產生足夠量的產物用于分析。但如果這一過程能夠加快而不影響質量呢?在過去幾年，隨著DNA聚合酶和 PCR儀器的改造，PCR技術已經變得越來越快。然而，隨著人們對個性化醫療和基因檢測的興趣日益增加，也希望看到新的快速且高質量的PCR方法。目前，許多新的測序策略都依賴重新改造的聚合酶，這也預示著迷你PCR的革命。2014年，我們有望看到這些重新改造的聚合酶的更多應用，包括更快的PCR循環條件，更小、可移動的儀器，將PCR從傳統實驗室的局限中解放出來。

　　3. 更小：近兩年，單細胞成為大家關注的焦點。盡管我們有大量關于細胞群體的數據，但我們對單個細胞的行為還是知之甚少，比如它如何應對特定的刺激。在2013年，許多研究都關注單細胞水平的生物學，而研究人員也熱衷于每次對一個細胞進行研究。

　　盡管單細胞分析存在不少挑戰;起始材料的量太少，很難確保只有單個細胞。但隨著新技術的出現，如數字PCR和微滴式數字PCR，以及微流體技術的改進，研究人員也開始實現單細胞生物學的探索。到2014年，我們預計單細胞應用的數量會激增，而適用于單細胞的PCR方法也會如雨后春筍般冒出來，帶來新的生物學發現。

　　今年是PCR技術的“三十歲生日”。這些年來，從PCR到定量PCR再到數字PCR，技術在不斷發展，也帶來更廣泛的應用。下一個三十年，也許PCR會給我們帶來更多驚喜。

　　細胞分析

　　顯微鏡技術在過去幾年的進步是有目共睹的。我們能夠對過去無法成像的結構進行成像，也有了更豐富的顏色可供選擇。在這些發展的背后，是工程學和數學的進步，它們讓更多顏色和更高分辨率成為可能。那么，在未來的一年，細胞分析又會有哪些新進展呢?讓我們來猜猜看。

　　1. 深入大腦：對于技術上存在挑戰的領域，總是需要足夠的資金，來推動開發人員嘗試新事物。今年4月，白宮啟動了BRAIN計劃，其目標是解決一些棘手的顯微鏡問題，以幫助神經科學家繪制大腦回路更清晰的圖譜。其中之一是將利用MRI等技術獲得的大面積圖像與數百萬個神經元聯系起來。從那里，人們需要弄清楚神經元成像與單分子成像如何關聯。最后，這一切都會被拉到單一的數據框架內。這是個巨大的挑戰，但是隨著更多的開發人員整合成像模式，以加強神經科學的數據集，我們在 2014年有望看到一些重大進展。

　　2. 超高分辨率顯微鏡的采集時間更快：2013年，一些新技術出現，能提高超高分辨率顯微鏡的圖像獲取速度。這些進步可能為研究細胞過程的動力學以及在超高分辨率下觀察單分子鋪平道路。盡管目前仍在開發的起步階段，但我們預計明年會出現更多硬件和軟件的進步，這將讓活細胞超高分辨率顯微鏡更加強大，也更加普及。

　　3. 組織樣品的深度成像：儀器開發商已利用試劑讓組織迅速變得透明，從而增強顯微鏡的深度成像應用。在今年年底，一些新的多光子系統也被開發出來，可利用較長的波長實現1000 nm范圍及以上的成像，從而盡量減少組織損傷。在2014年，我們有望看到這些平臺的進步，以及新的熒光基團，讓更深層析的成像和分析成為可能。這一領域的下一個挑戰將是開發新的方法，來處理這些實驗所產生的大量數據。

　　2014年，我們還有望看到細胞分析技術的更多進步，包括干細胞培養和維護的培養基改進;新的自動化平臺出現，能快速分離單個細胞;以及細胞分析和成像的集成平臺的進一步完善。不過，真正的突破也許是一種全新的技術或方法，這沒人可預料。

　　蛋白分析

　　近年來，蛋白分析技術在范圍(高通量方法)和應用(新穎的蛋白質間相互作用分析方法)上不斷擴展。2014年，我們又將看到哪些進展呢?從更好的親和標簽到經過驗證的抗體，也許我們能從以下幾方面看到蛋白分析技術的進步。

　　1. 更好的親和標簽：盡管不是最有魅力的方法，但親和標簽仍是蛋白分離中必不可少的。目前，開發者還在不斷開發新方法，以期獲得更大量的純凈蛋白。隨著這些技術的進步，2014年研究人員有望獲得更多純化的蛋白，用于結構測定技術(如冷凍電鏡cryo-EM)和蛋白質相互作用分析。

　　2. 探索復雜的蛋白質相互作用：蛋白質相互作用分析已經走過了漫長的道路，但仍然需要繼續進步，以研究體內的蛋白質相互作用和復合物。最近幾個月，研究人員利用不同的熒光基團和蛋白標簽組合，已經在這方面有所進展。一種流行的方法是利用FK506結合蛋白與雷帕霉素結合域的誘導結合系統。

　　至于蛋白復合物，基于超高分辨率顯微鏡的結構測定已在過去幾年快速發展。今年7月，歐洲分子生物學實驗室的Jan Ellenberg及其同事在《Science》雜志上發表文章稱，他們利用隨機超高分辨率顯微鏡，直接觀察了核孔復合物的環狀結構。明年，我們有望看到更多以熒光顯微鏡為基礎的結構測定方法的出現，包括新的和改進的超高分辨率方法以及FRET方法在結構分析上的進步。

　　3. 抗體驗證引發關注：不完全的抗體驗證正成為許多研究人員的錯誤來源。今年9月，《Biotechniques》雜志上發表了一篇文章。作者稱Cdk1的兩個市售的單克隆抗體都是非特異的，與中心體蛋白Cep152有著交叉反應。這種非特異性使得作者之前的蛋白定位研究出現問題。然而，這并非個別現象。類似的情況之前也曾多次出現。隨著科學家對抗體驗證日益關注，我們預計2014年會有新的舉措來避免這一問題。

　　有趣的是，對于很多領域，一個方面的發展會推動另一方面。盡管親和標簽已經很成熟，但蛋白質組學其他方面的發展也會推動對增強型標簽和蛋白分離方法的需求。此外，隨著研究人員向高通量應用邁進，他們也需要一些技術，無需復雜的純化和分離。2014年，對蛋白科學家而言，也許是富有成效的一年。