人腫瘤抗原的識別與鑒定實驗——免疫沉淀法

本實驗用Dynabeads protein A 進行免疫復合物的純化。Dynabeads A 蛋白 （Dynabeads Protein A） 在免疫沉淀中有以下作用：

（1）將方案時間減少到 30 分鐘。

（2）顯著降低非特異性結合造成的背景

（3）保持蛋白質復合物的完整。對珍貴的蛋白質沒有物理壓力。

腫瘤細胞

PBS生理鹽水裂解液蛋白酶抑制劑

培養瓶細胞刮棒離心管低溫離心機-80℃冰箱探針型超聲波恒溫水浴鍋

一、 裂解細胞

1.  方向刮取細胞。將細胞懸液轉移到離心管，離心取沉淀，-80℃ 保存。（收集細胞要迅速，低溫下進行，以減弱蛋白酶的作用）

2.  裂解細胞。采用RIPA 裂解體系，使用前40℃ 預冷，按10⁷ 個細胞加入1.0 ml 裂解液，吹打混勻，加入適量的蛋白酶抑制劑
（如cocktail）， 冰上放置3~5 分鐘。

3.  超聲處理裂解液。使用探針型超聲進行多次適當頻率的短促沖擊，10~20秒/次，重復3 次，中間間隔10~20 秒，冰浴下進行。

4.  15 000 rpm，40℃離心15 min，吸取上清液于另一EP管中，置冰上。上清液用于下一步的預處理。

二、裂解物的預處理

使用正常人的血清對裂解物進行預處理。

1.  按1 ml 裂解物加2 ul 對照血清的比例加入正常人血清。

2.  室溫孵育2~3 小時，緩慢搖動。

三、免疫復合物的純化

1.  用Dynabeads protein A 進行免疫復合物的純化。

2.  將Dynabeads protein A 振蕩混勻，吸取100 ul 磁珠于EP 管中，置于磁鐵架（Dynal MPC）上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

3.  加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管，輕柔搓動管子約2~3 min，將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

4.  重復2 步驟兩次。

5.  清洗完磁珠后，加500 ul 預處理后的裂解物，反復搖動管子，室溫下反應10~20 min。

6.  將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，將上清轉移至另一EP管中。

7.  用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次。

8.  洗脫抗原-抗體復合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中，輕柔搓動管子約2~3 min，將P管置于磁鐵架上，吸取上清于一EP管。

9.  重復步驟7，將上清收集于同一個EP管洗脫樣品總體積為60 ul，作對照用。

10.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后備用。

11.  在步驟5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 ul 血清），緩慢搖動，室溫孵育2~3 h。

12.  將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上，棄上清。

13.  重復步驟6~8。共收集到兩份樣品，對照與病人的純化免疫復合物各60 ul。

14.  磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱儲液100 ul，40℃ 保存。

15.  在樣品中加入2xSDS 上樣緩沖液并用1 M NaOH 調節pH 至使溴酚藍呈藍色。

四、結果分析

1.  1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的樣品可直接進行一維凝膠電泳，或者對磁珠上的蛋白A 或蛋白G 進行耦聯劑修飾，洗脫后的樣品可進行Western Blot。

2.  RIPA裂解液：

150 mmol/L NaCl；1.0%NP-40；0.5%脫氧膽酸鈉； 0.1%SDS ；50 mmol/L Tris（ pH8.0）。

為了避免抗體的共洗脫，在繼續進行免疫沉淀之前，應該將抗體交聯到免疫磁珠,建議使用交聯劑。

Dynabeads protein A 捕獲的 Ig 量取決于起始樣品中 Ig 的濃度。 100 μl Dynabeads A 蛋白可從含有 20- 200 μg IgG ?ml 的樣品中分離約 25- 30 μg 人 IgG。 絕大部分位點與 Fc 結合，實現最優的 Ig 取向。