摘要 建立了一套通過大腸桿菌表達(H is) 6
2A rg2A rg2人胰島素原[ (H is) 6
2A rg2A rg2human p ro insulin,
RRhP I]制備重組人胰島素的工藝。將大腸桿菌中以包涵體形式表達的RRhP I 依次經過DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析, Sephadex G225 層析, 重組復性酶切轉化和Superdex75 分子篩, 制備重組人胰島素。SDS2PA GE、HPLC、氨基酸組成分析和小鼠驚厥實驗結果證明, 制備的重組人胰島素具有天然生物活性, 而且純度較高。
關鍵詞 重組人胰島素 純化 DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑 Superdex75
1 引 言
分離純化是基因工程藥物生產中極其重要的一環, 這是由于工程菌經過大規模培養后, 產生的有效成分含量很低, 雜質含量卻很高; 另外由于基因工程藥物是從轉化細胞, 而不是從正常細胞生產的, 因此對產品的純度要求也高于傳統產品。所以要得到合乎醫用要求的基因工程藥物, 分離純化要比傳統產品困難得多。在重組人胰島素(Recom b inan t hum anin su lin, rh I) 的基因工程生產中, 同樣面臨著下游處理非常復雜的問題。為了能有效地純化目的產物, 目前基因工程生產中普遍使用的是親合層析和HPLC等手段, 這些分離純化技術雖然分辨率高, 特異性強, 但十分昂貴。不利于降低成本。為了降低生產成本, 本研究建立了一套由(H is) 62A rg2A rg2人胰島素原[ (H is) 62A rg2A rg2 hum an p ro in su lin, RRhP I ] 制備重組人胰島素的下游純化工藝, 并對產品的性質和純度進行了鑒定。
2 材料與方法
2. 1 工程菌
RRhP I? pQ E240 大腸桿菌M 15 菌株。
2. 2 主要試劑
DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換劑, Sephadex, Superdex75, 胰蛋白酶和羧肽酶B, 低分子量蛋白, 人胰島素, 谷胱甘肽(氧化型和還原型),DTT, 其它化學試劑均為國產或進口飛行純。
2. 3 RRhP I 的初步純化
DEA E2瓊脂糖快流速陰離子交換層析柱用30mmo l?L T ris2HCl, 8 mo l?L 尿素, pH8. 0 平衡, 包涵體用30 mmo l?L T ris2HCl, 8 mo l?L 尿素, 50mmo l?L DTT , pH 8. 0 溶解后上柱, 用合適的氯化鈉梯度進行洗脫, SDS2PA GE 確定RRhP I 組分, 收集含RRhP I 的洗脫液。2. 6 復性及酶切轉化將初步純化后的RRhP I 在Sephadex G225 層析柱上脫尿素, 轉換緩沖液進行重組復性, 然后用胰蛋白酶和羧肽酶B 協同酶切將RRhP I 轉化為人胰島素(Hum an in su lin, h I) , 0. 1 mo l?L ZnCl2 終止反應并沉淀h I。
2. 4 h I 的純化
將h I 粗品用30 mmo l?L T ris2HCl, 8 mo l?L 尿素, pH8. 0 溶解, 在Superdex 75 上進行分離純化。層析柱的平衡液和洗脫液均為0. 2 mo l?L 乙酸鈉2乙酸, pH4. 0。
2. 5 HPLC 分析
在HPLC 儀上, 用ODS C18 反相柱(150mm ×6. 0mm ) 進行分析, 流動相為0. 2mo l?L(NH4) 2SO 4 溶液(1 mo l?L H3PO 4 調pH 至3. 5) 和50%乙腈水溶液按1∶1 (v?v ) 混合而成, 流速1. 0m l?m in, 檢測波長214 nm , 上樣量20 u l。
2. 10 氨基酸組成分析
稱樣品2. 5 m g, 加6 mo l?L HCl 2 m l, 110℃水解24 h, 蒸干后加入2 m l 無離子水溶解, 直接進樣,在氨基酸分析儀上進行氨基酸組成分析。
2. 11 h I 整體生物活性的鑒定
按2000 版《中華人民共和國藥典》的規定用小白鼠驚厥法鑒定h I 的整體活性。
3 結 果
3. 1 RRhP I 的初步純化
層析圖譜見圖1, RRhP I 主要集中在峰2。收集峰2, 進行SDS2PA GE 分析, 見圖2。結果顯示電泳條帶主要集中在13 KD 附近, 峰1 為穿透峰, 此峰中含有p I 高于8. 0 的和一些疏水性的蛋白質, 而絕大部分p I 低于RRhP I 的蛋白質和核酸類雜質牢固地結合在柱子上, 需要較高的鹽濃度才能洗脫下來。
表1 是6 次層析的重復實驗結果, 可以看出,RRhP I 的回收率較高, 穩定在75%～ 80% 左右。
表1 離子交換層析的RRhP I 回收率
Table 1 RRhP I recovery of DEAE-Sepharrose Fast Flow ionexchange chromatography
Test number (n= 6) RRhP I recovery (% )
1 75. 2
2 77. 0
3 75. 5
4 78. 2
5 79. 6
6 79. 8
x±s 77. 55±1. 81