2.2.2從富含多糖的植物組織中提取和純化RNA

0.75mol L檸檬酸鈉N-月桂肌氨酸(N-lauroyl sarcosine)硫氰酸胍緩沖液抽提緩沖液氯仿異戊醇2mol L乙酸鈉酸性苯酚異內醇乙醇2mol L乙酸鉀10mol L LiClTNE緩沖液TE緩沖液液氮

研缽和研杵離心機玻璃 Pasteur 吸量管

一 材料與設備

1)0.75mol/L 檸檬酸鈉，pH7.0(含檸檬酸）, 用 0.1%DEPC 處理并高壓滅菌

2)10%(m/V)N-月桂肌氨酸 (N-lauroyl sarcosine)

3) 硫氰酸胍緩沖液：用 293 ml 無菌去離子水，17.6 ml0.75mol/L 檸檬酸鈉,26.4m 丨 10%N-十二醇肌氨酸鈉，在廠家藥瓶內于溶解 250 g 硫氰酸胍 (不用稱重)

4) 抽提緩沖液：每 5 ml 硫氰酸胍緩沖液加 36ul 巰基乙醇。若被提取的組織中含多聚苯酚，抽提緩沖液中則可加入聚乙烯聚吡咯烷酮 (polyvinypoiypyrrolidone)(20%，m/m)

5) 氯仿：異戊醇 49:1(V/V)

6)2mol/L 乙酸鈉，加乙酸至 pH4.0

7) 酸性苯酚:500 g 晶體苯酚溶于 500 mli 離子水中，50 ml 每份于-20℃ 保存，4℃ 可保存一個月

8) 異內醇

9)70% 和 100% 乙醇

10)2mol/L 乙酸鉀，加冰乙酸至 pH4.8

11)10mol/L LiCl

12)TNE 緩沖液：10 mmol/LTris-HCl,PH7.5, 室溫，15 mmol/L,NaCl，1 mmol/LEDTA

13)TE 緩沖液:l0 mmol/LTris-HCL PH7.5 1 mmol/LTEDTA

14) 研缽和研杵

15) 液氮

16) 離心機

17) 玻璃 Pasteur 吸量管，200℃ 干烤至少 3 h


二 操作方法

1) 在液氮中將 0.4 g 組織研磨為細粉末，勿讓組織解凍

2) 在研磨過程中，加入 3.5 ml 抽提緩沖液，充分研磨。將勻漿轉移到一個 10 ml 聚丙烯管=用 1 ml 抽提緩沖液沖洗研杵和研缽，然后移至聚丙烯管中。

3)23000 g，4℃, 離心 20mim

4) 用烤過的玻璃吸量管將 hS 懸浮液移入 l0 ml 聚丙烯管。

5) 加 0.4 ml2mol/L 乙酸鈉，混勻。加 4 ml 苯酚，混勻。加 0.8 ml 氯仿：異戊醇，混勻。

6) 聚丙烯管置于冰上 15 min

7) 離心，方法如步驟 3)

8) 用烤過的玻璃吸量管將上層懸浮液移入 30 ml 聚丙烯管，加入同樣容積的 2mol/L乙酸鉀，混勻。

9) 聚丙烯管置于冰上至少 30 min

10)44000 g，4℃ 離心 20 min。

11) 將上清液移入 15 ml 聚內烯管，加 0.6?1 倍體積的 100% 的預冷異丙醇，混勻，-20℃ 放置 45 min

12) 以 27OOOg，于 4℃ 離心 20 min

13) 輕輕倒出上清液，用 Iml70?乙醇洗滌沉淀，如步驟 12 離心 3mim 盡可能將乙醇倒凈。

14) 加人 400ulDEPC 水溶解沉淀，移至 1.5 ml 管中。

15) 加 100ul10mol/LLiCl, 放置至少 2 h。

16)12000 g，離心 20 min

17) 用 1 ml70% 乙醇洗滌沉淀兩次

18) 加入 200ulTNE 重懸沉淀，再加 500ul100% 乙醇，-20°C 放置至少 15 min。

19) 如步驟 16 離心 5mim。

20) 用 lml70% 乙醇洗滌沉淀兩次。

21) 加入 200?400ulTE 重懸沉淀。

22) 將每個樣本稀釋 30?50 倍，在 230mn、260mn、280nm 測量光吸收值。

1) 最初的離心除去了大部分不溶性多聚糖，如淀粉顆粒。殘余的組織在管的底部形成暗綠色沉淀 (若用的是葉子），不溶性多糖在殘余組織上面形成灰白色膠狀層

2) 當吸取上清液時，應十分小心，勿攪亂膠狀沉淀，因為該層非常軟。上清液的體積大約 4 ml，若因沉淀多面使液體體積明顯不足時，用柚提緩沖液補足

3) 加人乙酸鉀后，延長孵育時間（達 30 min) 會提高 RNA 的質景，尤其在出現蛋白污染時。多糖會形成灰白色膠狀沉淀。若所用的組織多糖含量髙. 延 K 孵育時間（至 60 min) 也有助于沉淀更多的多糖

4) 加人異丙醇后，不應看到沉淀，任何可見的沉淀是表明大量多糖的存在. 孵育時間大于 60 min，就會形成多糖沉淀

5)RNA 沉淀應為白色，若有灰白色膠狀沉淀則為多糖污染。遇到該情況，將沉淀再懸浮于 200ul TE, 加 1 倍體積的 2mol/L 乙酸鉀，冰上孵育 30 min。12000 g，4°C 離心 20 min. 將上清液移至一新 1.5 ml 管中，用 2.5 倍體積的 100% 乙醇沉淀RNA,-20℃15 min。繼續方法中的步驟 16)

6) 判斷 RNA 分離的成功與否，可通過測量在 230nm、260nm、280mn 處的紫外吸收來評估 RNA 的產量和質量。若 A_260/230 值小于 2, 則表明多糖和/或多聚苯酚污染；若A_260/280 比值小于 1.7, 表明蛋白污染，在瓊脂糖凝膠匕出現的 28S 和 18S rRNA，可用以評 估 RNA 的完整性

7) 該法提取的 RNA 適于 poly(A)+ 的分離，Northern 印跡分析，cDNA 分析，RT-PCR 擴增。