280納米光吸收法測定蛋白質濃度實驗

由于蛋白質分子中常酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環結構，在紫外 280 nm 波長處有最大吸收峰，其吸收值與蛋白質濃度成正比，故可用 280 nm 波長吸收值大小來測定蛋白質含量。

待測蛋白質樣品

實驗用緩沖液（空白對照）

分光光度計（配備紫外檔） 石英比色杯 用于溶液轉移的吸管和吸球

1. 單道分光光度計

1.1 將實驗用緩沖液加入比色杯中 ，將 A₂₈₀ 值調至零。

1.2 吸去緩沖液對照加入樣品，記錄值 。

2. 雙道分光光度計

2.1 將儀器調零。

2.2 將樣品和對照分別加入樣品杯和對照杯中，然后記錄光吸收值。

1. 實驗室中常犯的錯誤是認為用 1 cm 的比色杯所測光吸收值為 1.0 時，蛋白質溶液濃度大約為 1 mg/ml，這是非常不精確的。以下比較了不同的標準蛋白質在 1 mg/ml 時的光吸收值。

2. 這一技術被廣泛用在柱層析時監測蛋白質洗脫峰的出現，但是除非使用更特異的方法，A₂₈₀ 值并不能代表洗脫蛋白質的量，可使用快速和靈敏的蛋白質定量方法如 Brad-ford 或蛋白質點雜交結合測定法。

3. 玻璃和塑料在紫外吸收光范圍內具有光吸收值，因而不能用來進行蛋白質的定量。

4. 如果所測值超過測量范圍，應將樣品用緩沖液吸收后再測量，或使用更小的比色杯來測量。

5. 如果實驗所用的緩沖液和水相比有較高的光吸收值，這說明緩沖液中有感染物質存在。適度的緩沖液的光吸收值可通過調零來平衡。但是由于干擾物質的偏離光影響在高的光吸收值下，分光光度計的靈敏度范圍變窄。

6. 修改測定方法可部分改正由于干擾物質和蛋白質組成不同所引起的誤差，其中包括檢測 A₂₈₀/A₂₆₀ 的比值和 A₂₈₀/A₂₃₅ 的比值。

7. 當有核酸存在時，可進行如下修正：

蛋白質濃度（mg/ml）=1.5×A₂₈₀ - 0.75×A₂₆₀

8. 如果 A₂₈₀/A₂₆₀ 約為 2，這時可忽略溶液中核酸的光吸收值。