2.8.2乙型腦炎病毒RNA提取

酚氯仿異戊醇乙醚KAc乙醇DEPC 處理水TBE 緩沖液上樣液KCI。

透析袋

一 材料與設備

1) 酚：氯仿：異戊醇 (25:24:1),

2) 乙醚

3)2.5mol/LKAc

4) 乙醇

5)DEPC 處理水

6)TBE 緩沖液

7〕上樣液：40% 甘油，0.4% 啡叮溴紅的 TBE 溶液

S) 透析袋

9)KCI

二 操作方法

1. 酚：氯仿：異戊酵提取法

1) 蔗糖密度梯度離心純化的病毒與等體積飽和酚：氯仿：異戊醇（25:24:1) 混合，冰浴中振蕩 3?5 min。

2) 在 4℃ 下，8000 g 離心 lOmin，吸出上層水相，再用同樣方法處理第二次，獲得的上層水相用乙醚洗滌；二次去酚，水相加 1/10?體積的 2.5mol/LKAc 及 2 倍體積乙醇，在—20℃ 下保存

2. 瓊脂糖凝膠制備電泳純化法

1) 制備 1.2% 瓊脂糖-TBE 凝膠。

2) 在離心去乙醇的 RNA 小管中，加入 40?80ul 電泳上樣液，上樣進行電泳。電泳液為 TBE，電 60?100V, 電泳 3?6 h

3) 切下含病毒 RMA 區帶的凝膠條，裝入透析袋，內加 0.5?2 mlTBE, 袋的兩端用線或普通木夾或塑料夾）封口，放在電泳槽中再次進行電泳。約 lh 后 RMA 走出凝膠，吸出袋內 RNA, 加 KC1 至 0.25mol/L，加 2 倍體積乙醇，在一下保存。

3. 乙型腦炎病毒 RNA 純度檢查

1) 乙型腦炎病毒 RNA 感染性的鑒定可用小白鼠腦內滴定來完成，也可以在麥胚無細胞蛋白合成系統中測定其 mRNA 活性。

2) 測定分子質量大小，乙型腦炎病毒 RNA 在瓊脂糖凝膠電泳中為單一區帶。RNA 大小標記物可用正常動物細胞的 18SRNA 和 28SRNA, 在小白鼠細胞中，這兩種 rRNA 的分子質量分別是 0.7X10⁶Da 和 1.65Xl0⁶Da

1) 為了獲得高滴度病毒，要選擇對乙型腦炎病毒敏感的培養細胞。對子 c6/36 培養細胞，病毒繁殖滴度髙，并 R 病毒能對該細胞造成持續感染，細胞病變輕微。病毒感染后，培養 2?4 天，收獲病毒，又可以換上新鮮培養液繼續培養，這樣就能從一批培養細胞中不斷獲得含病毒的上清液。

2) 提純的病毒 RNA 在 -20℃ 乙醇中比較穩定，至少可保存 2 個月。