試劑、試劑盒：
實驗步驟：
3.1 Cleveland 肽圖譜[5]
( 1 ) 樣品進行 2D-PAGE 分離，然后用考馬斯亮藍（CBB ) 染色，去除含有蛋白質點的凝膠碎片。
( 2 ) 用電泳濃縮儀洗脫凝膠中的蛋白質，2W 恒功率洗脫 2 h。洗脫后，再用 MQ 水透析兩天，再凍干。
a. 從 2D 膠中切下藍色蛋白質點，用 MQ 水浸泡。
b. 在裝有蛋白質點（含有 5~20 塊凝膠碎片）的 2 ml 離心管中加入 750 μl 電洗脫緩沖液搖晃 30 min。
c. 將 12~15 cm 長的透析膜（小號，no.24，Wako，Osaka，Japan ) 放入 250 ml MQ 水中（用 300 ml 燒杯）煮沸 5 min。同時用 MQ 水浸濕小片玻璃紙。
d. 關閉裝有透析膜的容器的小口，打開容器的大口，裝上透析膜，扭轉，用夾子夾住加以封閉（圖 18-1A ) 。
e.
將這個容器連接在電泳濃縮儀上（圖 18-1B；Nippon Eido，Tokyo，Japan )
。將含有蛋白的凝膠碎片放到玻璃紙上（玻璃紙連接在容器的小口上），加 750 μl
電洗脫緩沖液。在容器的兩端加入電洗脫緩沖液，容器兩端通過緩沖液連接起來，這樣蛋白質就可以從小口玻璃紙上轉移到大口的透析膜上。加入電洗脫緩沖液，裝有蛋白質的小口部分要和正極連接。
f. 2W 恒功率通電跑 2 h。
g. 去除透析膜，用夾子夾住加以封閉，在 4°C 透析，第一天換水（去離子水）3 次，第二天換水（MQ 水）2 次。
h. 將蛋白質溶液置于 2~6 個 2 ml 的離心管中，冷凍干燥過夜。
i. 將蛋白溶解于 30 μl 的 SDS 抽樣緩沖液中。
(
3 ) 蛋白質溶解于 20W 的 SDS 抽樣緩沖液中（pH 6.8)，然后上樣，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳。將含有 10 μl
金黃色葡萄球菌 V8 蛋白酶（Pierce，Rockford，1 L )。( 0.1 μg/μl）和 10 μl SDS 抽樣緩沖液（pH
6.8 ) 的溶液覆蓋在蛋白質樣品上。開始電泳，直到當蛋白質樣品和蛋白質酶匯聚到濃縮膠時，關閉電源。30 min 消化蛋白質，然后繼續電泳。
a. 用夾子固定玻璃板（100 ml X 140 mm X 1 mm ) ，玻璃板間為 1 mm 間距。
b. 在 100 ml 的燒杯中制備分離膠溶液。混合溶液，灌膠使膠面低于板上部 3 cm ( 提示：當加了 10% APS 和 TEMED 后要立即灌膠）。
c. 用 1 ml 的 MQ 水覆蓋分離膠。
d. 將膠置于室溫下 40~60 min 進行聚合反應。
e. 倒掉過多的水，準備灌入濃縮膠溶液。
f. 在 100 ml 的燒杯中制備濃縮膠溶液，灌入分離膠上，插入梳子。
g. 將膠置于室溫下 20 min 聚合。
h. 拔出梳子，卸下夾子，去掉硅膠條。
i. 用注射器清洗加樣孔。
j. 將玻璃板安裝到電泳槽上，倒入 SDS-PAGE 電泳緩沖液。
k.
蛋白溶解于 20 μl SDS 抽樣緩沖液中（pH 6.8)，然后上樣，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳。將含有 10 μl 金黃色葡萄球菌
V8 蛋白酶（0.1 μg/μl）和 10 μl SDS 抽樣緩沖液 ( pH 6.8 ) 的溶液覆蓋在蛋白質樣品上，加入 30 μl
的溴酚藍溶液。
l. 開始電泳，直到蛋白質樣品和蛋白酶匯聚到濃縮膠時，關閉電源，30 min 消化蛋白質。
m. 35 mA 恒流跑電泳，直到溴酚藍指示線到達距底部 5 mm 處。
n. 停止電泳，取出玻璃板。
o. 用抹刀分開玻璃板。
p. 去掉濃縮膠，取出分離膠。
3.2 N 端及內部氨基酸序列分析，氨基酸序列的同源比較分析
( 1 ) 經過 2D-PAGE 或 Cleveland 方法分離的蛋白通過半干轉移印跡儀電轉移到 PVDF 膜上（Pall，Port Washington，USA ) ，然后通過考馬斯亮藍染色觀察。
a. 剪一塊 PYDF 膜，大小和膠一樣。
b. 剪一塊 3 MM 沃特曼濾紙，大小和膠一樣。
c. 用甲醇清洗 PVDF 膜幾秒鐘，再將膜放入 100 ml 的印跡溶液 C 中，輕搖 5 min。
d. 分別在印跡液 A、B、C 中浸潤兩張印跡濾紙（3 MM) 。
e. 將分離膠放入 100 ml 印跡液 C 中，輕搖 5 min。
f. 用 MQ 水潤濕半干轉移印跡儀，將浸濕在印跡液 A 中的濾紙放在印跡板上，再放上浸濕在印跡液 B 中的濾紙。如有氣泡應全部消除。再依次放上 PVDF 膜、分離膠和浸濕在印跡液 C 中的濾紙。
g. 接通電源，以 1 mA/cm2 的電流跑 90 min。
h. 用 100 ml 的 MQ 水清洗膜。
i. 用考馬斯亮藍染色 2~3 min。
j. 用 60% 的甲醇脫色 3 min，共兩次。
k. 膠在用 MQ 水洗后，室溫干燥。
(
2 ) 將染色的蛋白質點或條帶從 PVDF 膜上切下，放置于氣相蛋白質測序儀 Procise 494 或 cLC ( Applied
Biosystems，Foster City，CA ) 反應室的上部玻璃區域，運用 Applied Biosystems 提供的標準程序進行
Edman 降解，得到的乙內酰苯硫脲氨基酸（PTH ) 通過在線高效液相色譜（HPLC ) 進行分離，根據保留時間進行鑒定。
( 3 ) 通過網絡 FastA 程序搜索 Swiss-Prot，PIR，Genpept，PDB 數據庫，得到的氨基酸序列跟數據庫中已知的蛋白質進行比較分析。
3.3 印跡蛋白質的去封閉 ( 見注釋 1)
1. 乙酰絲氨酸和乙酰蘇氨酸
N 端含有乙酰絲氨酸和乙酰蘇氨酸的蛋白質通過電轉移轉到 PVDF 膜上，帶有蛋白的 PVDF 膜切下來后用三氟乙酸 60°C 處理 30 min，然后進行蛋白質測序（見注釋 2)。
2. 甲酰化基團
甲酰化蛋白通過電轉移轉到 PVDF 膜上，PVDF 膜切下來后在 300 μl 0.6 mol/L HCl 溶液中在 25°C 處理 24h。之后將膜用 MQ 水洗干凈，干燥完后可進行測序。
3. 焦谷氨酸
( 1 ) N 端含有焦谷氨酸的蛋白通過電轉移轉到 PVDF 膜上。
( 2 ) 帶有蛋白的 PVDF 膜切下來后用 200 μl 100 mmol/L 的冰醋酸 [ 含 0.5% 聚乙烯吡咯烷酮碘 PVP-40 ] 在 37°C 處理 30 min ( 見注釋 3) 。
( 3 ) 用 1 ml 的 MQ 水洗膜 10 次。
( 4 ) 用 100 μl 0.1 mol/L 的磷酸緩沖液（pH 8.0 ) ( 含 5 mmol/L 二硫蘇糖醇和 10 mmol/L EDTA ) 浸潤 PVDF 膜。
( 5 ) 加入 5 μg 焦谷氨酰肽酶后，30°C 處理 24h。
( 6 ) PVDF 膜用 MQ 水洗凈，干燥后用于測序。
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