T4 DNA 連接酶可將雙鏈復合物缺刻連接，其中包括 RNA-DNA 雜合鏈及 RNA-RNA 雜合鏈。
| 實驗材料 | T4DNA 連接酶T4 多聚核酸激酶RNA 供體受體寡核苷酸 cDNA 模板 |
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| 試劑、試劑盒 | 10X 連接緩沖液[Y32P]ATP無 RNase 水l0 mmol LATPRNasin。無 RNase 的 DNase。5XTBE2X 變性膠上樣緩沖液TE |
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| 儀器、耗材 | 真空離心濃縮儀 |
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| 實驗步驟 | 一材料與設備
1)T4DNA 連接酶
2)T4 多聚核酸激酶
3)RNA 供體
4) 受體
5) 寡核苷酸 cDNA 模板
6)10X 連接緩沖液：500 mmol/LTris-HCl(pH7.5)，100 mmol/LMgCl2，200 mmol/LDTT,0.5 mg/mLBSA(適用 NewEngtandBiolabs 連接酶）或 660 mmol/LTris-HCl(pH7.6)，66 mmol/LMgCl2,lOOmmol/LDTT(適用于 Amersham/USB 連接酶）
7)[Y32P]ATP(10mCi/ml,300Ci/mmol=3.33umol/L)
8) 無 RNase 水
9)l0 mmol/LATP
10)RNasin。
11) 無 RNase 的 DNase。
12) 真空離心濃縮儀。
13）5XTBE:54 gTris，27.5 g 硼酸，20 ml0.5mol/LEDTA(pH8.0)
14)2X 變性膠上樣緩沖液：10mol/L 尿素，1XTBE 或 80% 甲醛，1XTBE
15)TE；10 mmol/LTris-HCl(pH8.0),lmmol/LEDTA
二、操作方法
1. 磷酸化 3＇RNA
1) 在 1.5 ml 管中加入 5ul[γ32P]ATP(50ulCi,16pmol)，用真空離心濃縮儀干燥。
2) 在此管中加入：0.5ul10X 連接緩沖液，3ul20umol/L3＇RNA,1ul 水，0.5ulT4 多核苷酸激酶, 終體積為 5.0ul
3) 于 37℃: 孵育 30?60 min
4) 于 75°C 孵育 l0min 或 92?95℃ 孵育 2 min, 滅活多核苷酸激酶。置于冰上
2. 連接反應
1) 在滅活的多核苷酸激酶反應管中，加 1.0ul10×連接緩沖液.3.0ul20umol/L5＇RNA,3ul20umol/LcDXA 模板。
2) 加熱至 75℃ 2 min 再室溫放置 5 min, 雜交 RNA 與 DNA。
3) 在雜交反應液中加入 1.l0 mmol/L 冷 ATP，2ul T4DNA 連接酶，至終體積 15ul
4) 于 30°C 孵育 2?4 h。
5) 加 lul 無 RNase 的 DNase, 于 37℃ 孵育 15?30 min
6) 加 16ul 2X 上樣緩沖液，上樣電泳，可以檢測到標記的 5＇RNA 與 3＇RNA 以及相成于連接產物的全長分子。 收起 |
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| 注意事項 | 對于有效的連接，橋梁 cDNA 模板的濃度非常重要，最好等于或介于兩種待連接的 RNA 分子的濃度之間，如模板過量，RNA 分子就會與不同的 cDNA 模板結合，而無法同另意 RNA 分子結合。我們建議連接反應中 RNA 的濃度最好為 0.1?10umol/L |
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