引子：從06年12月份開始，斷斷續續做了一個多月的3’RACE，有了一些心得和體會。期間看了很多前輩們分享的經驗，受益匪淺。在這里，我就自己的經歷略作總結，希望能給像我一樣的新人們有點啟示，少走些彎路，不當之處歡迎指正。
一、試劑盒的選擇：3’RACE從原理上就能明白，它比5’RACE 要容易得多，所以并不一定需要用進口試劑盒。原來準備用Takara 3’RACE的試劑盒，可是看了一下它的原理和內容，覺得挺挫的，自己DIY可能效果更好一些呢。于是根據 Invitrogen GeneRacer Kit 自己DIY了，效果不錯。找來了：Invitrogen的SuperScript III反轉酶，TAKaRa LA Taq酶、Pyrobest高保真酶。
并根據 Invitrogen GeneRacer Kit，自己合成了3’接頭引物(侵犯了人家知識產權)：
3’接頭：3'ap 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACGGCATGACAGTG (T)18 -3'
54 bases
3’外側：3'Primer 5’-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′ 25bases 76°C
3’內側：3’Nested Primer 5’-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3′ 23bases 72°C
二、體會與心得
１、RNA的質量： RNA的質量對于3’RACE的成功至關重要， RNA的質量不好，其他全是白忙活。剛開始用了師兄半年前的RNA做不出來，后發現是由于RNA降解了，用新的RNA后問題就解決了。
所以提完了RNA后別怕麻煩，驗證一下質量再往下做（看看OD260/280的值，再電泳檢查一下），免得后面出了問題都沒法找原因。
２、引物質量：引物的重要性也是在實驗過程中慢慢體會到的，它往往是決定性的因素。剛開始為保險起見，我對應Invitrogen GeneRacer Kit提供的3’引物設計了內外兩對引物(準備做巢式PCR，GSP1- 3’Primer and GSP2- 3’Nested Primer )，BTW：Invitrogen認為較高退火溫度的引物特異性好一些。
剛開始按部就班的做，先用GSP1- 3’Primer去擴增 ，再用GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。也遇到了RACE常見的問題，3’-race第一輪PCR目的條帶非常弱（沒法回收），還伴有嚴重的smear。
這就要解決二個問題： １）減少非特異性擴增。 ２）增加目的片段的產量。當時，優化了一些PCR條件，試了Touch down PCR，也用第一輪PCR產物作模板用GSP1引物做二次PCR ，也用了GSP2- 3’Nested Primer做巢式 PCR 。Touch down PCR、二次PCR的效果都不好。用巢式 PCR能得到目的片斷，但效果也不怎么樣。
后來，一次心血來潮直接用GSP2- 3’Nested Primer做第一輪PCR，直接就擴增到了效果較好的目的片段（如下圖），后來用高保真酶擴增時也只需要一輪PCR 就可以了。由此可見，引物的質量是決定性的。一對好的引物，不需要很費事的去優化條件就能得到好的結果；而一對特異性不怎么好的引物，即使用很多方法去優化也很難得到理想的結果。
３、擴增條件的優化：影響PCR的因素很多,但我覺得這其中模板質量、引物質量、引物退火溫度是最具決定性的因素。而諸如：模板濃度、引物濃度、熱啟動、酶量、延伸時間、PCR循環次數、是否Touch down PCR，這些都是錦上添花的因素。
也就是說，如果目的條帶能擴增出來，優化一下條件能擴增得更好；但是如果目的條帶壓根就擴不出來，你在這些錦上添花的東西上花再多精力也沒用，這時候就應該考慮在決定性因素上找找原因。