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摘要： 學習克隆工作中最常用的雙酶切,將外源基因與質粒連接方法及操作技術. 一、實驗目的： 1、學習克隆工作中最常用的雙酶切；2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術；3、學習氯化鈣法制備 大腸桿菌 感受態細胞的技術；4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義.5、外源質粒 DNA 轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術.6、學習鑒定重組子的方法. 二、實驗原理： 重組子的建立：采用雙酶切 質粒 載體pBR322和pUC18,酶切后產生了互補的粘性末端,在T4 DNA 連接酶的作用下,兩個質粒片段連接.感受態細胞(Competent cells)：受體細胞經過一些特殊方法(如：CaCl,RuCl等化學試劑法)的處理后, 細胞膜 的通透性發生變化,成為能容許......閱讀全文
該實驗主要有兩個用途：1．重組質粒的鑒定。當質粒的重組或其它載體重組后，通常會發生質粒的重組失敗，包括質粒的自身環化。因而要求進行篩選，把重組成功的質粒找出來。在目前常用的質粒和其它載體中含有相應的抗生素抗性基因，一旦重組成功，質粒環化（包括自身環化），抗生素抗性基因表達，被轉化的大腸桿菌便具備抗相
實驗步驟 一、桿狀病毒表達載體 最簡單的經典桿狀病毒表達載體是一個重組的桿狀病毒，其基因組含有一段外源核酸序列，通常為編碼目標蛋白質的dDNA，在多角體蛋白啟動子控制下進行轉錄。這個嵌合的基因由多角體蛋白啟動子和外源蛋白編碼序列組成
一、RNA 制備 模板mRNA 的質量直接影響到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的結構特點,容易受RNA 酶的攻擊反應而降解,加上RNA 酶極為穩定且廣泛存在,因而在提取過程中要嚴格防止RNA 酶的污染,并設法抑制其活性,這是本實驗成敗的關鍵。所有的組織中均存在RNA 酶,人
PCR引物決定PCR的特異性，引物的設計就顯得尤為重要。下面以已知DNA序列設計引物為例介紹設計引物應考慮的幾個方面：1、GC比值：眾所周知,堿基對中的GC之間有三條氫鍵，AT之間有兩條氫鍵，GC和AT在引物序列中的合理比例是設定PCR中退火溫度的重要依據。通常在一個引物中GC和AT各半即可。2、長
隨著PCR技術的不斷發展成熟（擴增長度、保證性、產量和特異性等），質粒構建過程的大多數細胞內的DNA復制將被PCR這一細胞外的DNA復制所代替，質粒構建效率將有質的飛躍。4.4密碼子的偏好性的原則酵母菌對外源基因的表達也和外源基因密碼子的選用有關。了解表達系統宿主在密碼子使用上的偏愛性對從翻譯水平分
（二）Ti質粒轉化植物細胞的戰略 １ . Ti質粒的改造 有以下理由使天然的Ti質粒不能作為表達載體使用： a. 生長在培養基上的植物轉化細胞產生大量的生長素和分裂素阻止了細胞再生長為整株植物，因此，必須除去生長素和分裂素基因。 b. 有機堿的合成與T-DNA的
一、實驗目的1、學習克隆工作中最常用的雙酶切；2、學習將外源基因與質粒連接方法及操作技術；3、學習氯化鈣法制備大腸桿菌感受態細胞的技術；4、了解細胞轉化的概念及其在分子生物學研究中的意義。5、外源質粒DNA轉入受體菌細胞的技術以及篩選轉化體的技術。6、學習鑒定重組子的方法。二、 實驗原理重組子的建立
實驗方法原理 主瓊脂板上和覆蓋于另一塊瓊脂板表面的硝酸纖維濾膜或尼龍膜上的細菌克隆可以被定位， 經過一段時間，已經在濾膜上生長的克隆可以被原位裂解以備雜交之用。同時，主瓊脂板可置于
PCR體外擴增法 實驗方法原理 Adeasy系統利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度濃縮等優點，并
實驗方法原理 主瓊脂板上和覆蓋于另一塊瓊脂板表面的硝酸纖維濾膜或尼龍膜上的細菌克隆可以被定位， 經過一段時間，已經在濾膜上生長的克隆可以被原位裂解以備雜交之用。同時，主瓊脂板可置于 4℃ 保存，直到篩選的結果出來為止。實驗材料 E.coli試劑、試劑盒 LB 或 SOB 瓊脂板儀器、耗材 硝酸纖維素
連接反應的策略 可以采用幾種策略來進行外源ＤＮＡ片段和質粒載體的連接。對此，可依據外源ＤＮＡ片段未的性質，以及質粒載體與外源ＤＮＡ上限制酸切位點的性質來作出選擇。（一）外源ＤＮＡ片段未的性質帶有各種未的外源ＤＮＡ的克隆方法見下表：──────────────────────
實驗概要本實驗將人Bcl-2重組質粒轉化DH5α擴增菌，轉化后在含Amp的培養基上進行篩選，生長的菌落即為含重組質粒的工程菌。含人Bcl-2重組質粒的DH5α菌用于質粒DNA的擴增，獲得的質粒將作為限制性內切酶的酶切底物DNA。實驗原理轉化是將外源DNA分子導入到受體細胞，使之獲得新的遺傳特性的一種
小量細菌克隆的雜交法篩選實驗步驟，一、材料1. 培養基含有適當抗菌素的 LB 或 SOB 瓊脂板。含有氯霉素的 LB 或 SOB 瓊脂板。2. 專用設備(1) 硝酸纖維素膜（Millipore HAWP，或類似產品）或尼龍膜。濾膜不必是無去污劑污染或無菌。(2) 注射器（3cc )，針頭（18 號）
實驗概要本技術以pBS質粒、E. coli DH5α為例介紹了重組質粒的連接、轉化及篩選。實驗原理本實驗所使用的載體質粒DNA為pBS，轉化受體菌為E.coli DH5α菌株。由于pBS上帶有Ampr 和lacZ基因，故重組子的篩選采用Amp抗性篩選與α-互補現象篩選相結合的方法。因pBS帶有Amp
實驗概要本實驗將釀酒酵母作為胞內晶體蛋白的攜帶和表達宿主，同時，作為可能的營養體喂養海洋線蟲P. redivivus將所表達的目的蛋白導入線蟲機體，觀察線蟲的生長、發育、繁殖或是死亡情況，探討胞內晶體蛋白對昆蟲病原線蟲以外的線蟲是否具有營養作用。為此，首先構建一種重組大腸桿菌，其所攜帶的重組質粒能夠
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自殺性質粒載體：一般用于基因突變。將突變的目的基因克隆到自殺性質粒載體上，通過接合等使其進入宿主，由于在宿主菌中不存在復制基因啟始所需的復制蛋白（如Pi蛋白等），其無法復制，在外界選擇性壓力的作用下,自殺性質粒載體所攜帶的突變基因就與宿主染色體上的野生型發生基因發生二次同源重組，產生了帶有突變的突變
重組DNA技術可以用于：（1）據需要選擇目的基因（DNA片段）在體外與基因運載體重組，轉移至另一細胞或生物體內，以達到改良和創造新的物種和治療人類疾病的目的；（2）是現代分子生物技術發展中最重要的成就之一，即是基因工程(Gene Engineering)的核心技術。實驗方法原理Adeasy系統利用了
重組腺病毒構建，擴增及純化基本技術操作（細菌內同源重組AdEasy System）一 目的基因的克隆（以pshuttle-CMV質粒為例）1. 選擇適當酶切位點，進行酶切連接，將目的片段插入pshuttl-CMV質粒多克隆位點。2
中國農科院棉花研究所針對 20 多個棉花品種，成功建立了高效、穩定的規模化轉化體系，以流水線的操作方式，建立了高效、工廠化的棉花轉基因技術體系。本文援引中國農業科學院棉花研究所的發明專利內容，以制備轉 GAPDH 基因棉花的具體方法為例，以應用實例演示棉花轉基因技術的具體應用案例。土壤鹽漬化是一個全
摘要： 下文介紹大腸桿菌感受態細胞的制備和轉化. 1、感受態細胞的概念重組 DNA 分子體外構建完成后,必須導入特定的宿主(受體)細胞,使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀,這個導入過程及操作統稱為重組DNA分子的轉化.
六、重組質粒的轉化【實驗目的】學習和掌握感受態細胞的制備方法和轉化實驗的基本操作。【實驗原理】將重組質粒轉入大腸桿菌的過程稱為轉化。轉化所用的大腸桿菌需要用物理或化學方法特殊處理，使重組DNA分子容易進入細胞內，被處理后易于接納DNA分子的細胞稱作感受態細胞。下面介紹感受態細胞的制備。【實驗試劑與器
實驗步驟一、桿狀病毒表達載體最簡單的經典桿狀病毒表達載體是一個重組的桿狀病毒，其基因組含有一段外源核酸序列，通常為編碼目標蛋白質的dDNA，在多角體蛋白啟動子控制下進行轉錄。這個嵌合的基因由多角體蛋白啟動子和外源蛋白編碼序列組成，其位于病毒基因組多角體座位，替代了非必需的野生型多角體基因。在實驗室中
原核表達系統是常被用來研究基因功能的成熟系統，由于原核表達系統具有包涵體蛋白不易純化、蛋白修飾不完整等缺陷，人們也開始利用真核細胞表達系統來研究基因。自上世紀70年代基因工程 技術誕生以來，基因表達技術已滲透到生命科學研究的各個領域。并隨著人類基因組計劃實施的進行，在技術方法上得到了很大發展，時至今
體外連接的重組DNA分子導入合適的受體細胞才能進行大量復制，增殖和表達，其首要目的是獲得大量的克隆基因。雖然PCR技術，體外轉錄及翻譯系統能部分達到大量擴增的目的，但畢竟受到體外操作的許多限制。重組質粒導入宿主細胞最常用的方法之一就是轉化（transformation）。轉化這一概念來源于遺傳學：細
【實驗目的】掌握T克隆的原理和方法。了解質粒提取的原理和方法。【實驗原理】外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA 連接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP存在的連接緩沖系統中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA
【實驗原理】外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組，這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA 連接酶的作用下，有Mg2+ 、ATP存在的連接緩沖系統中，將載體分子與外源DNA分子進行連接。Taq DNA聚合酶擴增的PCR產物，其DNA雙鏈前后末端都有一個游離的A堿
1.1.4接合轉化接合（Conjugation）是指通過細菌細胞之間的直接接觸導致DNA從一個細胞轉移至另一個細胞的過程。這個過程是由結合型質粒完成的，它通常具有促進供體細胞與受體細胞有效接觸的接合功能以及誘導DNA分子傳遞的轉移功能，兩者均由接合型質粒上的有關基因編碼。在DNA重組中常用的絕大多數
第一節 轉化基因片段在體外只是一段核酸分子，是化學物質，無法表現出遺傳物質的生命活性。只有當其存在于活細胞后，生命的特征才能充分展示出來。在分子克隆實踐中，在體外操作的核酸分子只有進入細胞以后才能達到克隆的目的。一、重組DNA分子轉入原核生物細胞1. 重組質粒DNA分子轉化大腸桿菌轉化（transf
實驗方法原理 離心機和轉頭，沸騰的水浴鍋， Dounce 勻漿器，晶型塑料或超明亮型吊桶式離心管，聚丙烯管，刀片，預設到 30°C 的振蕩水浴，預設到 4°C 和 65°C 的水浴