5分鐘超快速定量蛋白質組學研究COVID19感染分級標志物

　　視頻提要：本視頻由弗朗西斯·克里克研究所Markus Ralser博士錄制，簡要回顧代謝通路研究的內容和方法，重點介紹其團隊建立的5分鐘超快速蛋白質組學工作平臺，使用SCIEX TripleTOF?質譜系統及SWATH^?采集技術。Markus Ralser博士也展望Scanning SWATH^? 采集方法未來在超快速蛋白質組學應用中的優勢，包括掃描速度更快且蛋白質鑒定準確性更高。他們在實驗室嘗試了更極限的1分鐘甚至30秒的高速液相梯度，Scanning SWATH 采集方法依然能夠鑒定到1000個左右蛋白質。視頻中涉及SCIEX產品及技術包括：TripleTOF? 6600系統，SWATH 采集技術、Scanning SWATH 采集技術。

　　Markus Ralser 博士是代謝研究領域的專家，目前擔任德國柏林夏里特醫學院生物化學研究所 (Charité-Universit?tsmedizin Berlin) 和英國倫敦弗朗西斯·克里克研究所(Francis Crick Institute)代謝分子生物學實驗室主任。Markus Ralser博士課題組的研究方向主要是基于對細胞穩態和對外界刺激反應的研究來更好地了解代謝過程和發現藥物開發的潛在靶點。由于實驗中需要對大批量的樣本進行蛋白質組學的定量分析，因此Markus Ralser博士課題組與SCIEX 建立了長期的合作，共同構建穩定、快速、高通量的實驗平臺。

圖1：弗朗西斯·克里克研究所Markus Ralser博士在Cell Systems雜志在線發表文章，介紹其通過超高通量臨床蛋白質組方法研究新冠肺炎感染患者的潛在27個蛋白質分級標志物（圖片來源：Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24. ）

　　近期，Markus Ralser博士課題組在Cell Systems (細胞系統, 簡稱 CELL SYSTM) 雜志上發表了一篇題為”Ultra-High-Throughput Clinical Proteomics Reveals Classifiers of COVID-19 Infection ”(超高通量臨床蛋白質組揭示新冠肺炎感染分級標志物) 的文章。文章基于SCIEX 特有的SWATH 采集模式搭建了一套適用于大批量臨床樣本檢測的超高通量蛋白質組學定量平臺。該平臺使用常規分析型液相色譜搭配SCIEX TripleTOF?6600系統，在SWATH采集模式下實現了5 分鐘完成一個臨床樣本的蛋白質組學定量工作。因此，該平臺每天可以進行超過180個樣本的檢測，極大減輕了COVID-19病毒大流行時期的樣本檢測壓力，能夠幫助更快更準地篩選出潛在的治療靶點。因此，超高通量蛋白質組學定量平臺的應用將蛋白質組學從研究工具轉變為快速反應并可適應傳染性疾病暴發的臨床技術。

圖2：本圖描述從樣本收取、貯存、前處理到質譜采集和數據分析的流程，涉及SCIEX TripleTOF? 6600系統（圖片來源：Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24. ）

　　那么，SWATH采集技術是如何來實現如此快速、穩定、高通量的蛋白質組學定量檢測的呢？

　　SWATH 采集技術是一項非數據依賴型(DIA)數據采集技術，在采集TOF MS/MS二級譜圖時， Q1（四極桿）按照方法設定好的固定窗口或可變窗口，將設定的質量范圍劃分成幾個或幾十個小的質量范圍，然后將這些小的質量范圍依次傳輸到Q2（碰撞池）中進行碎裂，獲得該質量范圍內所有母離子的碎片信息，繼而定量到更多的蛋白質。來自于全球十多個實驗室的科研人員在各自的實驗室內使用SWATH 采集技術進行數據采集，實驗室之間的高度一致的實驗結果有力地證明了SWATH 采集技術具有很好的重現性（Collins et al, Nat Commun. 2017 Aug: 8(291)）。

　　因此，SWATH采集技術是一種非常適合于進行生物學研究以及臨床研究的數據采集技術。而且，SWATH 采集技術高質量、高穩定性的數據結果，可以實現在保證選擇性的前提下將采集時間進一步縮短，從而提高檢測通量。Markus Ralser 博士在文章中對5 min超短梯度下SWATH 采集數據的穩定性進行了考察。如圖1所示，對患者血漿樣本進行10次重復采集后，第一次進樣和第十次進樣能夠保持很好的一致性。而且，實驗證明，在連續采集的409個樣本中，245個蛋白具有87%的數據完整性，182個蛋白具有99%的數據完整性。由此，基于SWATH 采集模式的超高通量蛋白質組學定量平臺的數據穩定性和準確性都得到了很好的驗證。

圖3： 左圖為SWATH 采集技術重現性考察。基于超快速SWATH 采集方法對血漿樣品進行十次重復實驗，將第一針總離子流圖（藍色曲線）與第十針總離子流圖（紅色曲線）重疊，可見該方法具有很好的重現性。左圖中還展示了十針重復后采集的空白樣品總離子流圖（黑色曲線），以此證明該方法不存在交叉污染的風險。右圖對409個樣本的定量結果進行了統計分析， 245個蛋白具有87%的數據完整性，182個蛋白具有99%的數據完整性。（圖片來源：Messner et al., 2020, Cell Systems 11, 11–24.）。

　　為了獲得更深度、更完整的覆蓋結果，Markus Ralser博士課題組又將SCIEX新推出的Scanning SWATH 采集技術運用到了超高通量的蛋白質組學的定量平臺中。Scanning SWATH 采集技術是SCIEX與瑞士蘇黎世聯邦理工學院共同開發的成果。區別于SWATH 采集技術中Q1分段的質量范圍選擇和傳輸方式，Scanning SWATH 采集技術中Q1會按照一定的窗口大小（一般為3 Da、5Da或者10Da）在掃描質量范圍內連續滑動 (如圖2所示)。因此Scanning SWATH 采集可以做到更小的質量隔離窗口，提供更好的譜圖的專屬性。同時，由于四極桿的特點決定，質量窗口越小，靈敏度越高。而且Scanning SWATH 采集技術的Q1可以達到3000 Da/s的掃描速度，因此可以設置更小的循環掃描時間更加適合于快速液相方法。

圖4：SWATH 和Scanning SWATH 采集技術在1個循環 Q1掃描方式不同：SWATH 采集方法中Q1按照方法設定好的固定窗口或可變窗口，將設定的質量范圍劃分成多個窗口，每個窗口之間都由1 m/z重疊（左上圖）；Scanning SWATH 采集方法中Q1會按照一定的窗口大小在掃描質量范圍內連續滑動（左下圖）。兩者均可以提供保留時間信息（右上）。而Scanning SWATH 采集方法中特定母離子被Q1掃描窗口覆蓋到的起點和終點各不相同，因此還可以提供Q1維度的信息（右下圖）。（圖片來源：Messner et al., Doi: http://dx.doi.org/10.1101/656793 ）。

　　基于Q1連續滑動這一基本原理，Scanning SWATH 采集技術除了可以提供保留時間（RT）、每個Q1窗口的碎片離子和每個碎片離子的強度這三個維度的信息以外，還可以提供第4個維度信息，即碎片離子和母離子的相關性。這是因為在Q1 連續滑動的過程中，Q1的掃描范圍會有重合的母離子區域，不同質核比的母離子所產生的碎片離子將會在Q1不同采集區域內出現和消失。通過數據算法，就可以精準的建立碎片離子和母離子的相關性。Markus Ralser博士在講座視頻中介紹到，新增的Q1維度信息將使Scanning SWATH 采集技術的數據能夠更準確地判斷碎片離子的歸屬，降低假陽性（如圖3所示）。另外，在數據處理的過程中，引入了Q1維度信息進行打分，可以獲得更多的母離子信息，其FDR<1%的比例也明顯提高。

圖5： 左圖展示了Scanning SWATH 采集結果中母離子的FDR（假陽性率）分布情況（紅色圓點表示引入Q1維度信息的分布結果，藍色圓點表示未引入Q1維度信息的分布結果），由此可見Q1維度信息使得定量結果更加可靠。右圖對比了真實存在與假陽性兩種情況下子離子的出峰情況，Q1維度信息可以提供特定母離子的子離子出峰位置（即圖中虛線表示的位置），以此來判斷碎片離子的歸屬，降低假陽性。（圖片來源：RUO-MKT-17-11866-A. https://sciex.com/videos/Ultra-high-throughput-proteomics-In-COVID-19-research）。

　　因此，Scanning SWATH 采集技術可在短時間內產生四維數據信息，為母離子和碎片離子之間的相關性提供更多信息，提高了定性和定量的可信度。另外，它也是一種永久保存樣品的有效手段，可以創建包含大量一、二級掃描產生的數據記錄。在蛋白質組學、代謝組學和其它組學研究中，Scanning SWATH 將助力客戶開展精準醫學研究。當然，Scanning SWATH 能夠獲得如此優秀的實驗結果，Triple TOF? 6600+系統的硬件支持必不可少。

　　TripleTOF? 6600+系統是一款專為定量分析而研發的高分辨質譜，可以配備OptiFlow?離子源和接口，讓用戶在常規分析流速、微升流速和納升流速之間根據實驗條件任意切換，并且不會打破真空狀態，大幅提升這款產品的靈活性。升級的SteadSpray?探針電極技術使低流速檢測方法可以輕松實現，同時全新的硬件設計提高了儀器的抗污染能力，從而延長儀器穩定運行的時間。更重要的是， TripleTOF? 6600+系統提供了3000Da/s的Q1掃描速度，同時TOF提供了200 赫茲的SWATH^?采集掃描速度以及更寬的線性范圍，確保了Scanning SWATH^?采集模式下能夠獲得更好的數據結果。