60萬美元買來的儀器3年過氣怎么辦？看你會不會改造

過時的基因組測序儀不一定非得淘汰不用，研究人員可以稍加改造，讓它們在下一代生物化學研究中發揮余熱。

　　在斯坦福大學的一個地下儲藏室里，十幾臺DNA測序儀被拆解開來，價值數十萬美元的攝像頭、激光器以及光學和流體控制器散落在地，它們都來自名為GAIIx的Illumina第二代DNA測序儀。地板上，一臺舊儀器只剩一個空殼。“感覺自己像一個囤積狂。”斯坦福大學生物物理學家William Greenleaf說。

這個下一代生物化學平臺被稱為“寧靜號”，由一臺舊Illumina測序儀的元件組裝而成。

　　Greenleaf的實驗室有18名成員，因為這些舊儀器，其中約有一半的人在過去6年里都投入進了一項特別的工作當中。大多數研究人員使用DNA測序儀都是為了測序，但Greenleaf團隊卻屬于少數那一派，他們把這些設備改造一番后用于截然不同的用途，即大規模研究蛋白質和核酸生物化學，比如大分子的相互作用、RNA折疊和酶功能。

　　“這是一項革命性的技術。”斯坦福大學的生物化學家Dan Herschlag說。他利用該技術研究RNA和其它分子之間的相互作用，它可以提供“深入而廣泛的定量信息”，“使研究人員能夠建立更精確的生物物理和細胞模型來研究分子間的相互作用，這也是真正對生物系統進行預測理解的關鍵一步”。

　　從廣義上講，這項工作證明了當科學家深入研究硬件核心時，會創造出更多的可能性，也證明了陳舊或過時的設備不一定就沒有價值。

　　但是這種技術發展被形容成“出血邊緣”（bleeding edge）也不無道理，因為常常會出現錯誤。生物物理學家Sarah Denny今年剛從Greenleaf實驗室畢業，在被問及她的設備是否能夠“即插即用”時，她笑了。她說：“做實驗的時候經常有東西壞掉，你必須把它修好才能繼續。”但考慮到她能夠提取的數據量，這樣的代價是值得的。就Denny而言，她的團隊對RNA折疊有了更深入的理解，這就是自己動手的得與失。

　　芯片上的生物物理研究

　　2008年，GAIIx橫空出世，成為一時的熱門產品。一些測序中心有幾十臺GAIIx，每臺約60萬美元；一臺機器在一周時間內，就能完成300億個DNA堿基的測序。

　　但到了2011年，Greenleaf在斯坦福建立他的實驗室時，這個行業已被更快的硬件占領，比如Illumina HiSeq 2000。新一代測序儀更高效，對用戶也更友好，因此舊測序儀就這樣被棄之不用了。“它們基本上都變成了沒用的大塊頭。”Greenleaf說。

　　Illumina測序儀通過合成過程自動測序。DNA文庫被隨機排列在一個叫做“流動池”的裝置上，然后通過擴增形成大約1000個分子的小簇，每個代表一個遺傳信息片段。然后，DNA的組成（核苷酸）被轉移到芯片上，每個芯片都包含特有的熒光標記和可逆的化學修飾。

　　此過程保證了在每個簇上只能添加一個核苷酸。然后，測序儀對結果進行成像，并根據每個位置的顏色，“識別”或“讀取”添加的堿基。之后修飾被移除，再重復整個過程，通過識別一個個堿基最終獲得完整序列。

　　這些儀器的核心是高端顯微鏡和液體處理器，用以幫助移動試劑。其中一些組件，特別是攝像頭、激光器和移動臺，可能要花費數萬美元。2009年，麻省理工學院的RNA生物學家Christopher Burge意識到，或許可以通過改造這些硬件來做其它的研究。

　　改造的基礎

　　Burge表示：“GAII本質上是一個泵系統，它將物質泵到流動池中，然后再泵到一個高級成像系統中。因此我們意識到，或許它也可以把其它的東西泵到流動池中。”

　　這是因為GAIIx系統是一個“開放系統”，它通過可編輯的配置文件（recipes）進行控制，并且裝載了一些方便替換的試劑。機器內部同樣是開放的，由現成的第三方組件組裝而成。生物化學家Gary Schroth是加州Illumina公司基因組應用小組的負責人，他與Burge合作進行了早期研究，他表示：“現在想想，這好像是在高中進行的科學小組研究。”

　　相比之下，新的Illumina儀器更精細，并且采用定制硬件、硬線控制軟件和條形碼標記試劑，這些功能可以改善用戶體驗，但是也妨礙了改造。

　　Jacob Tome在康奈爾大學分子生物學家 John Lis的實驗室做研究生時，幫助改造了一個GAIIx。他回憶起與Illumina公司代表打過的 “許多個緊張的電話”，只為解決公司的儀器控制軟件難題。由于沒有現成的儀器重編程手冊，因此解決問題在很大程度上依賴于反復試錯。

　　Tome說：“我博士生涯中最令人興奮的一個星期是我們坐在測序儀前，通過自己編寫的配置文件，觀察溫度上升，觀察儀器在抽取什么溶液。” 

測序儀流動池的熒光圖像揭示了特定簇的結合反應。

　　不過，好在Burge得到了幫助。他的團隊與Schroth合作，修改了GAIIx配置文件以接受新的試劑，引入暫停功能，調整運行溫度并改變成像參數。隨后，研究人員利用該改良系統對酵母中一種名為Gcn4p的DNA結合蛋白的測序偏好進行了全面研究。

　　“我們首次證明可以把測序儀變成一種生物物理儀器，從而以極高的通量測量蛋白質-DNA的相互作用。”Burge說。

　　為此，Burge的團隊對通常在測序后便丟棄的流動池進行了處理，以便在每個簇中再生雙鏈DNA。然后，他們將熒光標記的Gcn4p蛋白引入芯片，逐漸升高蛋白濃度，并且通過修改后的軟件，讓測序儀對流動池進行成像處理，就仿佛它剛剛完成了另一輪測序。

　　通過下載和處理最終的圖像，而非通常輸出的堿基信息，團隊可以測量每個位置結合了多少Gcn4p，據此推斷出它對芯片上每條序列的親和力，總共獲得約4.4億個測量值。

　　“這是一個非常迷人且精妙的實驗。”Greenleaf說。它表明GAIIx平臺有潛力執行他所感興趣的所有測量，包括動力學測量、結合率、解離率和平衡常數，以及所有有助于從根本上理解DNA-蛋白質互作的物理測量。

　　一些研究人員使用類似的方法來解決他們自己的問題。例如，麻省理工學院的RNA生物學家David Bartel以信使RNA （mRNA）為研究對象，他的研究團隊發現，在mRNA分子末端的多聚腺苷酸尾“A”堿基數目與動物發育過程中基因產生蛋白質的效率存在關聯。

　　德克薩斯大學奧斯汀分校的生物物理學家Ilya Finkelstein改造了一個測序儀流動池，用以研究一種名為Cascade的蛋白質的DNA結合偏好。這種蛋白質被用在某一版本的基因編輯技術CRISPR–Cas中。Greenleaf團隊的一些成員與CRISPR的研究先驅、加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna合作，研究了為什么CRISPR中最常用的酶Cas9有時會在錯誤的DNA位置進行剪切。

　　研究人員還研究出了通過轉錄芯片上的DNA來創建超高通量的RNA陣列的方法，這種方法可以用來研究RNA -蛋白質的相互作用，或者用來篩選被稱為適配子的折疊RNA分子文庫。

　　要獲得這樣一個陣列，挑戰在于如何捕獲轉錄RNA。Lis和Greenleaf分別在雙鏈DNA分子末端引入了物理塊，使RNA聚合酶（產生mRNA分子的酶）和它的轉錄本停滯不前。在紐約威爾康奈爾醫學院，RNA生物學家Samie Jaffrey所在團隊（由化學生物學家Nina Svensen領導，那時她在實驗室做博后）利用一種特殊的病毒RNA聚合酶將新合成的RNA連接到芯片，然后添加了核酸酶來降解模板DNA。

　　針對某種疾病進行改造

　　對于斯坦福的生物物理學家Rhiju Das來說，這樣的RNA陣列已經成為一種識別可用于診斷活動性結核病分子的平臺。該項目源于一位同事發現了三種可區分潛伏結核和活動性結核的RNA標記。

　　他們面臨的挑戰是精確定位 “核糖開關”分子——實際上可以識別疾病的狀態。這樣的診斷分子必須能夠結合所有的三個RNA，外加一個熒光標記，并根據所存在的RNA改變形狀。“很明顯，這些條件讓人崩潰。”Das表示。

　　為了解決這個難題，Das為他聯合開發的一款在線游戲eterna招募了一群玩家。玩家的任務是設計出能夠以特定方式折疊的RNA；最有希望的結構被合成為DNA測序庫的一部分，每次10000個，并在GAIIx芯片上進行測試。每個設計有1萬個測量值，這就意味著每個實驗中大約有1億個數據點，這些數據會反饋給玩家以提高他們的技能。

　　Das說，隨著時間的推移，一些用戶變得相當熟練。“玩家現在已經發現了背后的基本原理，因此能夠得到完美的核糖開關——熱力學上最優，適用于各種測試。”

　　另外還有一項OpenTB挑戰賽（OpenTB Challenge）。在3輪游戲中，Das的團隊測試了187名玩家的近2.7萬個核糖開關，鑒定出了幾個似乎符合要求的開關。其中一個是由馬薩諸塞州一位退休工程師提交的，它在一種狀態下看起來像一個城堡的平面圖，而在另一種狀態下則像一個錨。現在，在蓋茨基金會的資助下，Das計劃開始測試其中部分設計是否能用于像檢測懷孕一樣來檢測結核病。

　　與此同時，一些科學家已經進入到下一步：將芯片上的RNA翻譯成蛋白質。2016年，Svensen表明她可以利用抗生素嘌呤霉素將肽固定在表面，從而在陣列上合成被稱為多肽的短蛋白序列。

　　今年6月，Greenleaf實驗室的博士后Curtis Layton報道開發了一種名為“大規模并行陣列蛋白質展示”（Protein display on a Massively Parallel Array）的方法，分析了SNAP-tag酶的156，140種變體。他想了解氨基酸序列與蛋白質功能之間微妙的關系。他表示：“能夠在這些機器上進行全新的蛋白質功能分析，真是太令人興奮了。” 

　　但是，這些令人興奮的工作并不容易：Layton花了四五年時間開發他的方法和硬件。Svensen花了兩年的時間開發出了自己的方法——現在被Jaffrey的實驗室用來創建一個全人類蛋白質組芯片。

　　她表示：“那時候給GAII買一個測序試劑盒需要5000美元。如果每一次實驗都得花這么多錢，那么你很難進行太多輪的優化。”因此，目前在英國鄧迪大學威康抗感染研究中心工作的Svensen主要在顯微鏡載玻片上做測試，或者使用本部門核心設施的廢棄流動池。

　　改造歷程

　　大多數GAIIx改造者使用的機器基本上保持了原樣，僅通過調整儀器軟件完成他們想做的。按照Jaffrey的說法，這使得任何一個身邊放著一臺GAIIx的人都可以使用它。“我們不想要只有工程師才能使用的東西，任何研究人員都可以利用這臺儀器開展我們的實驗。”

　　Greenleaf實驗室早期利用GAIIx進行的RNA研究也沒有什么不同。Layton表示，這個系統是由斯坦福大學的遺傳學家Patrick Brown捐贈，為了紀念《星球大戰》中的“千年隼號”飛船而命名的，飛行員Han Solo曾對這艘飛船發出呼喊：“聽到了嗎？堅持住！”

　　Layton說：“這是一臺舊機器，但是我們努力開發一些新用途，我們希望它不要有任何錯誤，不要帶來任何問題。但是，當它真正工作的時候，錯誤還是發生了。沒有人能這樣獲取數據。”

　　最終，團隊認定這種方法不可持續。Layton表示，不同于現在的按鍵界面的測序儀，GAIIx更像“阿波羅飛船”，而不是“千年隼號”。而新一代測序儀速度更快，讀長更長。此外，Illumina公司在2015年宣布將“終結”GAIIx，也就是說從2017年7月起不再提供相關流動池、試劑和部件。

　　團隊提取了該系統的光學器件、載物臺、相機、泵系統和激光器；用可以向下進行廣域照明的系統補充了測序儀內嵌的從下方以銳角照亮樣品的原有照明系統；設計了一種新的印刷電路板來操作激光器；從GAIIx部件中取出一個自動進樣器，使添加試劑的過程自動化；另外還增加了機載溫度控制器。

　　最重要的是，這個團隊設計了新的樣品支架，使GAIIx成像系統可以容納Illumina公司更小的新型MiSeq芯片。Greenleaf說：“這樣一來，我們能夠將熒光和測序的生物物理測量分開。”（Finkelstein同樣采用MiSeq芯片開展實驗，然后利用傳統顯微鏡成像。）

　　這樣得到的裝置令工程師倍感欣慰：一個緊湊的黑色立方體，表面看起來像是一臺被扯開的臺式電腦。Layton表示，最困難的部分是編寫控制硬件所需的軟件，并確定什么信號驅動什么動作。“這是一次艱難的探索。”他說。但總的來說，這個項目滿足了他對工程和軟件設計的業余興趣，更不用說生物化學了。

　　Winston Becker是該實驗室的一名醫學生，擁有雙博士學位和工程力學碩士學位。出于類似的原因，他被吸引到這個項目中來。“我想做一些偏物理和定量方面的研究。很明顯，能有機會運用儀器技術，制作儀器，是一件讓人興奮的事。”

　　但是，直接買一臺顯微鏡豈不是更簡單？根據Greenleaf的說法，這一選項并不存在，或者至少不是能夠負擔的選擇。“真的沒有什么現成可用的設備，”他說，“沒有任何設備能完成我們想做的事情。”他估計，定制一臺儀器可能要花費數十萬美元。

　　Das在Gr