Analyst：數字PCR數據的準確、可靠、非監督自動分類新方法

　　清華大學醫學院生物醫學工程系郭永實驗室在《分析學家》（Analyst）在線以封底（back cover）發表題為《一種雙熒光四分類微液滴數字PCR數據的準確、可靠和自動分類方法——密度分水嶺算法》（A density-watershed algorithm (DWA) method for robust， accurate and automatic classification of dual-fluorescence and four-cluster droplet digital PCR data）的研究論文，該研究將微液滴數字PCR的數據密度分布與分水嶺算法（一種圖像分割方法）有機結合，建立了一種微液滴數字PCR數據非監督分類的新方法。

　　微液滴數字PCR是一種單分子水平的核酸定量分析技術。通過將PCR反應體系分割為大量的微液滴，絕大多數微液滴內僅含有0個或1個模板分子，含有模板分子的微液滴在PCR擴增后呈現出較強的熒光信號。通過微液滴內熒光的檢測，可以得到微液滴數字PCR數據。依據熒光強度對該數據進行分類，即可判斷出含有模板分子的微液滴的數量和比例，最終通過泊松分布統計學計算，得到模板分子的絕對拷貝數。在上述過程中，微液滴數字PCR數據的分類是關鍵步驟，它直接影響到統計學計算的輸入，因而決定著微液滴數字PCR定量結果的準確性。目前，微液滴數字PCR的數據分類方法主要有兩種：一種是針對每種反應定制的監督分類算法，這些算法具有較高的準確性，但是針對不同的樣本類型和檢測指標，需要開發多種不同的分類算法；另一種是通用的非監督分類算法，但是它們的準確性和可靠性都不盡如人意，且時常會出現假陰性和假陽性的檢測結果。

　　為了解決上述不足，研究人員模擬人眼對微液滴數字PCR數據的分類過程，將微液滴數字PCR數據作為一幅圖像，提出了一種新型的數據分類方法——密度分水嶺算法。該方法通過數據密度分布的判斷，使用分水嶺算法自動地、非監督地將網格化（圖像化）的微液滴數字PCR數據沿著數據相對稀疏的位置分割為若干區域，最后通過這些區域的邊界實現準確、可靠、自動的非監督數據分類（圖1）。研究人員將密度分水嶺算法與現有主流商業化算法進行了比較，在人類表皮生長因子受體（EGFR）的L858R和T790M突變位點的檢測方面，密度分水嶺算法實現的檢測限是現有主流商業化算法的1/40，顯著地提高了微液滴數字PCR自動化檢驗的檢測能力。研究人員進一步使用Bio-Rad QX200和新羿TD-1兩種微液滴數字PCR系統，在254例冰凍組織、石蠟包埋組織和外周血臨床樣本上驗證了密度分水嶺算法，其中絕大部分（>84%）臨床樣本的定量結果優于現有主流商業化算法，且全部臨床樣本未出現假陰性和假陽性的檢測結果。

　　該研究為微液滴數字PCR的臨床應用提供了一種新的自動化數據分析思路，有望用于臨床的全自動核酸絕對定量。隨著精準醫療的發展，開發準確、可靠、全自動的單拷貝核酸定量分析方法對于疾病的篩查、診斷、用藥指導、病情監測和預后均具有重要意義。