BAC／PAC文庫的構建

EcoRⅠ消化的基因組DNA 載體DNA 電轉化感受態細菌細胞

5 X 緩沖液 EDTA 蛋白水解酶K PMSF 緩沖液 Not I 限制酶和緩沖液 瓊脂糖溶液 0.5 X TBE 緩沖液

SOC 培養基 LB 平板 LB 培養基 水浴鍋 激孔透析膜 離心管 軌道混合器 自動質粒隔離系統 軟質塑料96孔板

1.目標區域的大小

（1）如果基因組的目標區域很小（小于50kb），那么可以選擇黏粒載體甚至是λ噬菌體載體。利用現有的商品化的黏粒載體、高效率的包裝混合物和合適的大腸桿菌菌株，研究者可以方便的構建黏粒載體文庫。

（2）如果基因組的目標區域比較大，那么P1、PAC或者BAC就比較合適了。P1操作比較困難，PAC相對簡便。BAC載體也是很好的選擇，研究者可以利用現有的成熟產品來構建BAC文庫，比如EPICENTRE公司的一系列BAC載體及配套試劑盒。

（3）如果目標區域非常大（大于250kb），那么YAC載體就是首選了。不過，應用YAC載體來構建基因組文庫，操作非常繁瑣困難，一般由專門的公司來完成。

2.篩選文庫的難易程度

黏粒載體一般使用傳統的濾膜影印雜交來篩選，但是這種方法對于構建區域圖譜及疊連群來說既費力又浪費。大容量載體文庫，如P1、PAC、BAC、YAC，以二維陣列保存，既可以用傳統的單拷貝的探針雜交法篩選，又可以用PCR進行多克隆的群體篩選。而且，使用高容量載體構建文庫，可以減少染色體步查的步驟。

3. 載體拷貝數的考慮

當把大片段DNA片段克隆到高拷貝的載體時，克隆DNA會發生重組，從而影響克隆序列的保真性和穩定性；而單拷貝載體的低產量DNA是高通量分析的瓶頸。這個矛盾常常困擾著研究者。而EPICENTRE's CopyControlTM 克隆系統是對這些困難的最好的解決方案。CopyControlTM技術整合了單拷貝載體與多拷貝載體的優點。單拷貝載體能提高插入片段的穩定性，而且拷貝載體能在誘導劑的作用下，即時擴增出高拷貝數的克隆而獲得高產量的DNA。

四、將基因組DNA片段連接入載體

使用連接酶把上述大小合適的DNA片段連接入載體。商業化載體已經經過預處理，可以直接使用，無需內切酶消化及脫磷酸化處理。連接反應體系以100ul為宜。

注意：BAC載體連接完以后，需要將連接產物做脫鹽處理，除去連接反應緩沖液里的鹽分。

五、將重組載體轉入宿主細胞

1. 如果使用Epicentre試劑盒構建黏粒文庫，需要用Epicentre MaxPlax Lambda Packaging Extracts 來包裝上述的連接反應產物，測定包裝好的黏粒克隆的滴度，然后轉染Epicentre EPI300-T1?Plating Strain。挑出重組子，鑒定插入片段的大小。如果文庫的大小和質量都令人滿意的話，就可以鋪板進行文庫篩選，或者擴增、保存文庫。

2. 如果使用Epicentre試劑盒構建BAC文庫，應選擇電轉法，可以選擇Epicentre TansforMaxTM EPI300TM Electrocompetent E.coli 作為宿主，將上述連接產物轉入細菌，涂板長出克隆后。獲得克隆，研究者需要對BAC克隆的大小進行評估，確定文庫大小是否能夠滿足要求。Epicentre 文庫構建試劑盒中的EPILyse和EPIBlue，快速裂解克隆并電泳，可以方便的鑒定出BAC克隆的大小，從而估計出BAC文庫的大小。如果文庫大小合適，那么這個文庫就可以進行后續的操作了。

六、文庫克隆數的確定

基因組DNA文庫需要包含足夠多的克隆，來保證文庫的代表性。一般使用如下的經驗公式來確定：

N = ln （1-P ） / ln （1-f ）

P是希望得到的覆蓋率，f是插入片段大小與基因組DNA大小的比值，N是所需的克隆數。

舉例來說，用BAC載體構建人類基因組文庫，人類基因組大小為3 x 109 bp, 插入片段大小為100kb，希望覆蓋率99%，那么所需要的BAC克隆數為：

N = ln （1 - 0.99） / ln （1 - [106bp / 3 x 109 bp]） = -4.61 / -3.33 x10^-6= 138,298