原理:這一方法基于考馬斯亮藍G-250
有紅藍兩種不同的形式。在一定濃度的乙醇及酸性條件下,可配成淡紅色的溶液,當與蛋白質結合后,產生藍色化合物,反應迅速而穩定。反應化合物在
465-595nm處有最大的光吸收值,化合物顏色的深淺與蛋白濃度的高低成正比關系,因此可檢測595nm的光吸收值的大小計算蛋白的含量。
溶液:
1)Bradford儲存液
100ml95%乙醇
200ml88%磷酸
350mgServaG藍
室溫下長期保持穩定。
2)Bradford工作液
425ml雙蒸水
15ml95%乙醇
30ml88%磷酸
30ml Bradford儲存液
用濾紙過濾,保存于室溫棕色瓶中,可保存數周,但在使用前需要過濾。
3)配制1mg/ml牛血清蛋白(BSA)
做標準曲線:
取樣品即可測量。
注意事項:
1、樣品制備,樣品制備是做好2-d 的關鍵,樣品中離子濃度不能過大,最好用新鮮的樣品提取蛋白質,如果不確定蛋白提取情況,建議先跑sds-page檢驗。
2、上樣量的問題, ipg 膠條是13 厘米的上樣量在50ng-80ng之間,上樣量不合適,豐度低的將會被豐度高的所遮蓋。
3、ipg 膠條ph 的選擇,根據不同樣品選擇不同pH值。
4、針對不同的蛋白質,分離膠的濃度需調整。