CDNA文庫篩選
（一）λgt11 cDNA文庫鋪平板
宿主細菌制備
1．用一個E.coli宿主菌株單菌落分別接種2×5ml LB培養基（Y1088用于噬菌斑雜交，Y1090用于免疫篩選），于37℃振蕩培養過夜。
2．將過夜培養物以3000×g離心5min。
3．分別用2ml λ-dil（10 mmol/L tris-Cl,pH7.5; 10 mmol/L MgSO4; 高壓滅菌）重懸細胞沉淀。
4．細胞懸液可用于4℃貯存至一周。
預制噬菌體懸液鋪平板
以已知滴度（如，已知每ml噬菌體顆粒數）的cDNA文庫或其他噬菌體懸液開始，用λ－dil稀釋以達到所需每平板噬菌體數。每個90mm直徑平皿5×103個噬菌體/100μl開始篩選。
鋪平板
1．將所需數量的LB平板置42℃溫箱預熱。
2．LB頂層瓊脂（每平板最少2.5ml）用微波爐熔化，然后置49℃水浴中。
3．為溫箱內的每一個平板準備一個12ml帶螺旋蓋試管，于室溫，放在合適的架子上。
4．用移液器每管加100μlλ－dil稀釋的宿主細胞懸液。
5．每管加100μl稀釋的噬菌體懸液與細菌于漩渦器上簡短混合。
6．含細菌和噬菌體（感染混合物）的試管于37℃溫育25min，然后室溫放置。
7．用一支消毒的10ml玻璃移液管在本生燈火焰上稍稍預熱，取2.5ml保存在49℃的熔化頂層瓊脂加到一支含感染混合物的試管內。
8．立即在手掌之間滾動混合管內混合物，然后均勻地倒入一個預熱的LB平板上。
9．倒好的平板于室溫置水平面上直至頂層瓊脂凝固（至少5min）。
10． 重復步驟7至9，直至所有的細菌和噬菌體混合物都鋪平板。
11． 平板置42℃溫箱（對λgt11）直至噬菌斑長出。
（二）雜交篩選——cDNA序列作為探針
1．如上述將文庫鋪平板，噬菌斑雜交實驗用E.coli宿主菌株Y1088。
2．噬菌斑于42℃生長過夜。
3．從溫箱取出平板，置4℃冷卻至少1h。
4．膜剝離：首先，用軟鉛筆在干的硝酸纖維素濾膜上給準備影印的平板編號。其次，從平板的中央開始向邊緣小心將濾膜鋪在菌臺上。當濾膜完全變濕后（顏色變灰），再等30s。同時，用針頭在平板上標出濾膜的3個不對稱位置。小心將濾膜從平板上剝離，接觸面向上放在一張干凈的Whatman 3MM濾紙上。在進行下一步驟之前，所有的平板重復步驟4。
5．將濾膜接觸面向上漂浮在變性液（0.5 mol/L NaOH; 1.5 mol/L NaCl）中5min。
6．中和5min。
7．用2×SSC洗滌5min。
8．將濾膜放在一張新的Whatman 3MM濾紙上，用鉛箔將濾膜和濾紙一起包住。
9．在真空爐中80℃烘烤2h。
10． 用6×SSC預先短暫地濕潤濾膜，然后用預洗液（50 mmol/L Tris-Cl pH8.0; 1mol/L NaCl; 1mmol/L EDTA; 0.1% SDS）于68℃預洗滌至少1h。用一個盤子放在水浴搖床上。
11． 將25張濾膜轉移到一個裝有50ml雜交液（5×SSPE；1×Denhardt’s液；100μg/ml cT-DNA；0.1％SDS）的貯存罐內（直徑至少90mm），68℃預雜交2h。
12． 對于每ml雜交液，2倍的105至1×106cpm的雙鏈探針經沸水浴變性10min后，迅速放冰上冷卻。
13． 變性探針立即加到預雜交混合液中。
14． 在封口的貯存罐內于68℃雜交過夜，不斷地晃動以防濾膜粘在一起。
15． 雜交結束后，濾膜用2×SSC，0.01％SDS于室溫洗滌3次約1h。
16． 將潮濕（防止干燥）的硝酸纖維素濾膜放在一張硬紙或X光片上，用放射性墨水在針頭標簽上作標記。
17． 濾膜用塑料包裝袋（如Saran）包住，然后加上增感屏在X光片上于－70℃曝光過夜。
（三）免疫篩選
制備Sepharose偶聯細菌裂解液
1．各用一個E.coli溫度敏感溶源菌株（BTA 282（λgt11amp3）或BNN 97）單菌落接種于2×7.5ml培養基并于32℃生長過夜。
2．過夜培養物用LB培養基稀釋100倍，于32℃生長至OD600值為0.5。
3．于45℃溫育15min誘導噬菌體表達。
4．培養物于39℃進一步培養約2h。
5．測定噬菌體含量以便收集，氯仿測定操作步驟：3滴氯仿加到1ml培養物測試樣品中，混合物于37℃溫育。另一份不加氯仿的培養物作為平行對照。溫育5min后，測試樣品與對照比較。如果添加氯仿的測試細胞懸液清澈透明，細菌完全被吸附，剛好開始裂解，此時已可收集培養物。
6．于4℃以4000×g離心10min收獲細菌。
7．從開始的兩份7.5ml培養物離心得到的細胞沉淀用冷的偶聯緩沖液重懸并再次離心。
8．各用5ml冷的偶聯緩沖液重懸細胞沉淀。
9．超聲波處理細胞懸液，直到粘度增加至不再釋放出核酸。
10． 將細菌裂解物偶聯到預先制備好的溴化氰活化Sepharose 4B于4℃過夜。
11． 以3000×g離心5min回收偶聯物。
12． 用偶聯緩沖液重懸沉淀并再次離心。
13． 為了飽和溴化氰活化Sepharose的未結合反應基團，沉淀物用冷（4℃）的飽和緩沖液重懸并在旋轉輪上于4℃溫育1h。
14． 通過三次連續的洗滌除去未吸附蛋白質，開始用洗滌緩沖液（pH4.0）；然后轉換至pH8.0；最后一次洗滌pH為4.0，在這個處理前后和每次洗滌之間，在4℃，2500×g離心5min，收集材料。
15． Sepharose偶聯細菌裂解液可以PBS懸液（＋0.01％硫柳貢）于4℃貯存幾個星期。
用于篩選的抗體預吸附
1．濃度為0.5至1 mg/ml未稀釋的第一抗體和第二抗體（如過氧化物酶偶聯羊抗兔抗體，Calbiochem公司）分別用1.7倍體積的Sepharose偶聯細菌裂解液混合，并在旋轉輪子上于4℃溫育過夜。每次篩選循環約需要300μl已處理的第一抗體（最終工作稀釋度為1：100）和15μl已處理的第二抗體（最終工作稀釋度為1：2000）。
2．懸液加到少量玻璃棉填充的加樣器吸頭內。未封閉抗體用冷凍封閉液（至少5倍于柱體積）洗脫。
3．用冷的封閉液調節洗脫出的抗體濃度至原先濃度的1/20。加入硫柳汞（終濃度0.01％）。
鋪平板
1．如上所述鋪制平板，作如下修改：
a. 另外一支含2.5ml頂層瓊脂的12ml帶螺旋蓋試管置49℃水浴中以鋪制誘導對照平板。
b. 在一份感染混合物中，用100μl噬菌體懸液含已知百分比的具有完整β-半乳糖苷酶基因的野生型噬菌體作為誘導對照。
c. 在加相應感染混合物前，為鋪制誘導對照平板20μl X-gal立即加到2.5ml頂層瓊脂中。