CPSA2013分會：大分子的生物分析

　　2013年4月24~26日，第四屆中國上海化學與藥物結構分析會議 (CPSA Shanghai 2013)在上海浦東新區淳大萬麗酒店召開，來自國際知名藥企、跨國大制藥公司、中國CRO、生物醫藥研究所和高校的高管、專家、學者兩百余人參加了本次會議。其中在4月25日的分會上，舉行了以“大分子的生物分析”為主題的研討會，來自WuXi AppTec（藥明康德）公司的Dong-Bei Li女士，來自Frontage Laboratories的John Lin先生，以及來自Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu先生，分別做了相關的報道，來自ICON公司的Daniel Tang主持了該分會。

　　　　

CPSA 2013 大分子的生物分析 分會，主持人：ICON公司的Daniel Tang

　　WuXi AppTec（藥明康德）公司的Dong-Bei Li（李冬蓓）女士

　　首先，做報告的是來自WuXi AppTec（藥明康德）公司的Dong-Bei Li 博士，她帶來的報告是“Challenge in method development  -When small molecule meets large molecule assay”(方法開發的挑戰——當小分子遇上大分子)。

　　李博士首先講到，配合基鍵聯(ligand binding）方法用于小體積的分子時，具有一些缺點及優點。缺點是：缺乏特定的專一性（沒有內標，保留時間或質量標志特征），依賴于試劑（如抗體），較窄的定量范圍（非線性曲線擬合）；而其具有的優點是：高靈敏度（達pg/mL級，LC-MS/MS常為ng/mL），儀器不貴。接下來，李博士介紹了兩個例子：一個是用生物標志物方法測定雌二醇，一個是用PK方法測定ABC-101。

　　 第一例為測量人體中的雌激素水平。雌激素影響各種包括發育期和再生能力在內的生物過程。雌激素水平在絕經期后的婦女中急劇下降。在循環系統中，>85%的雌激素是鍵聯的血清蛋白。該實驗開發了一種分析人血漿中全部雌激素的分析方法，用于支持評估對于絕經后的、局部晚期或轉移后的乳腺癌患者，用抗癌藥治療臨床前III期的研究。雌激素分子量為272，現有主要方法是LC-MS/MS，LQC=375 pgm/mL。在用1-二甲氨基萘-5-磺酰氯（dansyl chloride）衍生后，離子對從272.3/156.3變為506.4/171.1，信號靈敏度提高了15倍，方法LQC從非衍生的375pg/mL到衍生后的25 pg/mL。L/MS/MS法的方法曲線顯示，靈敏度下限到10 pg/mL，但第一批臨床樣本的幾乎100%濃度都<10 pg/mL，所以該實驗停止，改用免疫法（immunoassay）。該實驗的挑戰是：樣本整體分析時間限為5個星期，大多數樣本已用LC/MS/MS法分析過，僅剩余有限的體積，所以需要一個可靠的方法，避免重復分析。從技術上來看，挑戰為：>85%的雌二醇是鍵聯到血漿蛋白上的，對靈敏度要求高，需達亞pg/mL。接下來，從所有的雌二醇試劑供應商中，篩選出達到靈敏度要求（pg/mL級）的兩個產品，然后通過實驗最終選擇Salimetrics kit。但實驗中發現其靈敏度仍不夠，并有較強的基質效應。后采用1-氯丁烷萃取，再進行ELISA方法的優化，最后形成了樣品的分析方法。該方法釋放了鍵聯的雌二醇，消除了基質效應，并濃縮了樣品2倍。總結來看，該實驗開發了一種檢測血漿中雌激素的方法，并獲得1 pg/mL的檢出限，獲得了成功的方法確證，日內、日間的CV% < 25%, AR < ±25%；并成功分析了樣品，99%的樣品獲得確證的結果，通過了ISR（24/28，±30%），滿足了時間期限，獲得了客戶滿意。　　

　　 第二例分析人血漿中一種脂肪酸修飾的藥，具有40個氨基酸，要求達到20 pg/mL靈敏度，抗體可獲得。夾心（sandwich）ELISA法，在用蛋白沉淀處理后，樣品被濃縮4倍，再用ELISA法。進行這種樣品處理后，雖在高濃度靈敏度提高，但在低濃度無優勢。這時考慮用玻璃樣品管替換塑料管，并在重組后的緩沖液中添加1%BSA和0.05% Tween 20，獲得好的結果。總結來看，該方法適用于小分子或肽，優勢是可濃縮樣品，減低基質效應；限制是需要更多的樣品處理步驟，仍舊要求抗體試劑；可在以下幾方面考慮：處理方法，保留配合基鍵聯的活性，提取，體積，儲液池等，提取效率和重現性，標準曲線或非提取的標準曲線。

　　Frontage Laboratories的John Lin博士

　　 來自Frontage Laboratories的John Lin博士，做題為 A Generic approach to antibody（mAb）quantitation in clinical samples by LC-MS/MS (臨床樣品中抗體定量的通用LC-MS/MS方法)。林博士首先綜述了LC-MS/MS的蛋白定量方法，然后舉例，接著談到LC-MS/MS的方法開發和方法確證，確證結果，用ELISA法進行交叉確證，在臨床樣品分析中的應用，和未來的展望。

　　 林博士首先談到，全球制藥工業已從小分子向大分子藥物研發轉移。美國FDA現已批準了超過600種生物藥；全球合成的治療用肽的市場已從2003年的53億歐元增長到2013年預估的115億歐元；2012年全球生物藥物的研發費用已超過了小分子的研發費用。

　　 在大分子定量中，林博士逐條對比了ELISA法和LC-MS/MS法的靈敏度、通量、開發時間、專一性、精密度和準確度、動態范圍、分析成本等。對于多數蛋白定量的LC-MS/MS法來說，均要求通過它的代表性肽（surrogate peptide）酶解和定量，僅有以下情況例外：較小的肽，因其無需酶解即可碎裂；以及少數報道中，用高分辨HRMS可定量完整蛋白。定量包含三個步驟：（1）酶解前分離（選項），（2）酶解（必需），（3）酶解后的分離（選項）。在第（1）步中，主要是將感興趣的蛋白從內源蛋白中分離出來，從而減少干擾、信號抑制、對酶的消耗。第（2）步包含還原、烷基化、酶解（主要為Trypsin）感興趣的蛋白。第（3）步主要用固相萃取法。

　　 關于樣品凈化，林博士談到其主要是具體情況具體分析，根據蛋白的性質和純化試劑的可獲得性。包括免疫捕獲（ImmunoCapture）；用Protein A/G，anti-IgG抗體進行通用的免疫捕獲；蛋白沉淀或固相萃取；蛋白沉淀；不采用任何酶解前的分離（沒有蛋白水平的分離）。

　　 在內標（IS）的選擇上，可用同位素標記的蛋白做內標；用蛋白類似物做內標；或同位素標記的肽做內標。

　　 接下來，林博士談到具體實例，分析BAN2401，它是一種人類的IgG1 mAB，作為治療阿爾茲海默病的潛在藥物。臨床前I期的藥代動力學研究中使用了ELISA法，但存在以下問題：靈敏度不夠（LLOQ為6ug/mL），主要的Ab是限制供應的，而希望的定量下限LLOQ要達到血清中500 ng/mL。改用LC-MS/MS法時，采用了如下的策略：（1）選擇出代表性（surrogate）肽，（2）LC及MS/MS的方法優化，（3）樣品處理法的探索（通用富集步驟，Protein A，Protein G，Anti-IgG1抗體），孵育，酶解；（4）內標的比較（抗體類似物 vs 氘代的surrogate肽)。膠內酶解后，選擇了兩個肽段，作為替代的肽用于后續分析。靈敏度比較后，選擇一個HT9（2＋）肽段作定量。再選用MORAB-022蛋白類似物作為內標，酶解后選擇ANSVWFR（2＋）做內標肽。

　　在樣品處理方法比較中，實驗表明Anti-lgG1抗體富集蛋白效果最佳。在定量時，有一組MRM通道用于定量，一組MRM通道用于確證。最后的實驗結果證明，靈敏度、定量限、精密度等都達到了要求。方法進行了確證，并和ELISA方法進行了交叉對比。該方法成功地完成了臨床前I期樣本的運行，如果提高通量，將可以支持臨床前II期的研究。林博士還提出了更多的改進方法的展望。

　　 林博士最后引用CT Viswanathan的一段話（Bioanalysis, December 2012, Vol. 4, No.23, 2763-2764）來展望：一旦新技術的利益風險比是有利的、明確的，可能具有實質性的數據（如果沒有廣泛的數據的話），監管環境將會擁抱新的技術。然而，在生物分析的科學社區和法規部門之間的合作，最好定位于：加強新技術的整體利益和可持續推動創新。

　

Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu博士

　　 來自Bristol-Myers Squibb公司的Guowen Liu博士，做了題為“生物治療藥物中LC-MS/MS的生物分析法”（LC-MS/MS Bioanalysis of Biotherapeutics in Drug Development）的報告。

　　 劉博士首先談到用LC-MS/MS法支持生物治療藥物的藥代動力學/毒代動力學（TK/PK）研究的現狀。人們對LC-MS/MS應用于生物治療藥物的定量都很感興趣，其使用的可能性也已被展示，但其應用還有一些限制，比如還沒有被法規部門明確接受，靈敏度還有限制，實驗人員的操作方面也有挑戰。

　　 在劉博士最近發表的論文（Liu G, et al. J. Chromatogr. A. 1284(2013) 155-162）中，他對LC-MS/MS用于生物治療藥物的方法做了詳盡分析。對于基質為血漿或血清的生物樣品，如果易于提取的話，就采用LLE、IA、蛋白沉淀等方法提取出來目標的蛋白，然后進行酶解，加入可溶性肽（SIL-Peptide）內標，再考察靈敏度，若足夠就直接采用LC-MS/MS法確證，如不夠則進行再處理（post digestion cleanup/enrichment）凈化、富集。而最初的樣品如果不易提取的話，可將樣品和血漿/血清基質一起酶解，再進行LC-MS/MS分析或處理、富集后再分析。

　　 接下來劉博士舉了三個例子，第一例是定量猴血漿中的BMS-X，這是一種pegylated的藥，其中Peg（聚乙二醇）為40 KDa，蛋白為11 kDa。定量監測一個代表性肽，用pegylated的類似蛋白做內標，LC-MS采用：Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500，樣品制備方面，在酶解前采用液液萃取（LLE），酶解后沒有進一步的凈化步驟。實驗進行了方法確證，包括準確度、精密度偏差，穩定性，交叉殘留，回收率。該方法的確證已通過了小分子的準則。

　　 第二例是定量血清中的單克隆抗體BMS-Y，分子量約為145 KDa，定量監測一個代表性肽，用可溶性肽SIL-peptide（酶解后加入樣品）和突變蛋白Mutated protein（一開始加入樣品）做內標，LC-MS采用：Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500，樣品制備方面，在酶解前采用蛋白沉淀法，酶解采用pellet digestion方法，酶解后沒有進一步的凈化步驟，整個樣品制備時間小于2小時。該例中，劉博士提到采用了一種特殊的酶解方式pellet digestion（Zheng ouyang et al.Bioanalysis, 2012 Jan；4(1):17-28）。實驗比較了采用可溶性肽內標和突變蛋白內標定量的結果，沒有明顯的差異，證明該酶解是一致性的。實驗進行了方法確證，包括準確度、精密度偏差，基質效應、酶解重現性、選擇性。并比較了LC-MS/MS法和ELISA方法的藥動曲線，一致性很好，結果顯示92％的樣品測定偏差在15％以內。

　　 第三例是定量BMS-Z（a domain antibody with a Fc tail），分子量約為80 KDa，定量監測兩個代表性肽，Peptide A為dAb和Fc間的連接子，Peptide B為一個存在于所有人的IgG1,2 Fc tail的常見蛋白。內標采用SIL-Peptide A和SIL-Peptide B。MS采用：Shimadzu Nexera和Sciex Triple Quad 5500，樣品制備方面，酶解采用pellet digestion方法，酶解后沒有進一步的凈化步驟。實驗進行了方法確證，包括采用Peptide A和Peptide B定量的準確度、精密度偏差；兩者的精密度、準確度都很高，Peptide A的長期穩定性更高。采用ISR（Incurred Sample Reanalysis,真正樣本再分析），Peptide A稀釋或不稀釋時都具有高度的重現性，而Peptide B的測定值大都比Peptide A高，兩者測定結果不一致，說明Peptide B可能不適于做BMS-Z的代表性肽。實驗比較了LC-MS/MS法和ELISA方法的藥動曲線，7天內兩者吻合度很高；超過7天后，LC-MS/MS的測定值要高于ELISA法，這可用免疫原性（immunogenicity）來解釋。整體看，Peptide A和Peptide B的樣本分析結果在方法開發和方法確證時是一致的。

　　 最后劉博士總結，應用現有的標準，幾種不同類型蛋白的LC-MS/MS法可被確證；LC-MS/MS和ELISA法結果比較一致；LC-MS/MS法是一種優良的生物分析法的補充性技術；需要仔細地選擇出正確的代表性肽，因為不是所有的肽都可以代表整個蛋白的。