CRISPR專家發表CRISPR／Cas9綜述

　　CRISPR技術的確在科學界掀起了基因組編輯的狂潮。在Pubmed中快速檢索“CRISPR”，目前已有1400多項結果。也相繼有專家為該技術撰寫了綜述論文，例如：Science綜述：CRISPR-Cas9系統的歷史和未來；北大魏文勝最新發表CRISPR綜述。

　　最近，來自美國加州大學伯克利分校和布羅德研究院的CRISPR專家John Doench和Ella Hartenian在國際知名學術期刊《FEBS J》發表題為“Genetic screens and functional genomics with CRISPR/Cas9 technology”的綜述文章。

　　在這篇綜述中，兩位專家首先簡要總結了CRISPR/Cas9的發現和特征，然后將這一技術與其他的基因組工程技術進行了比較。

　　該綜述討論了這一技術在遺傳篩選中的首次應用，回顧了以前用于功能性遺傳篩選的幾種技術，以及這些技術進行遺傳篩選所存在的問題。然后作者介紹了將CRISPR技術用于遺傳篩選的幾項報道，著重關注如何優化精確打靶活性，減少該技術中存在的脫靶效應。

　　重要的是，這篇論文對CRISPR技術的未來挑戰和機遇進行了評論。作者認為，在過去幾年當中，利用CRISPR技術所取得的進步是令人驚訝的，但是未來還存在著許多機遇和挑戰。例如，來自化膿性鏈球菌（S. pyogenes）的Cas9是研究的第一種Cas酶，并將繼續被廣泛使用。而研究人員也將開始探索來自于其他物種的Cas9蛋白，有幾千種Cas9蛋白質是原核生物內生性的，可能更適合于不同的研究目的。化膿性鏈球菌Cas9很大，因此很難被有效地包裝進眾多病毒載體。更小的Cas蛋白已有描述，但是不能被完全開發以廣泛用于遺傳篩選和常規基因組編輯。

　　作者還指出，CRISPR系統的RNA成分也值得進一步完善。通過產生更大的數據集和更強的建模技術，研究人員將繼續設計優化各種sgRNA序列，以提高精準打靶活性，并避免脫靶效應。

　　盡管產生位點特異性dsDNA斷裂有所改善（先是用ZFNs，然后是TALENs，現在是用Cas9），但是外源性提供的DNA序列的位點特異性集成，在許多細胞類型中仍然是一個效率高度低下的過程。而且，全基因組關聯研究的大多數顯著相關性，存在于基因組的非蛋白質編碼區，因此內源性位點的基因編輯，是充分了解特定變體如何影響細胞狀態的唯一方法。當前的方法，通過分析數百個單細胞分離體來尋找一個成功編輯的克隆，并不能很好的擴展到高通量。

　　最后，作者還提出了改進這一技術的幾種可能性。例如，通過siRNA為基礎的關鍵組件敲除抑制非同源末端連接（NHEJ）率，可能創建一個臨時窗口，在這個窗口中同源重組是受青睞的修復路徑。加強被編輯細胞的檢測也是一種可能性，當前的標準方法要求細胞被溶解，以通過核酸內切酶或測序為基礎的分析來檢測編輯事件，從而要求細胞的預先擴增和復制，為了恢復活克隆的事后檢測，往往以多孔板的分析形式。以混合模式檢測特異序列的能力，例如通過使核酸酶失活的Cas9與擴增的熒光信號結合，將使我們能夠使用流式細胞技術富集成功被編輯的細胞。最后，基于模板的修復，也可以通過將鄰近的修復模板帶到修復部位而得以改進，而不是目前在細胞中隨機擴散的方法。這些方法和其他方法，將是實現基因組編輯實驗大規模應用所必需的。

　　總而言之，CRISPR是第一個基因組編輯技術，可以很容易地通過使用廉價的、易于組裝的試劑在任何實驗室中進行操作，從而使得基因組編輯過程更加大眾化。雖然我們處于CRISPR技術的鼎盛時期，但是，對于充分了解這一系統并擴大其潛在應用來說，我們還處于早期階段。