Biogen于1978年由幾位著名的生物學家，包括愛丁堡大學的Kenneth
Murray、麻省理工學院的Phillip Allen Sharp，以及哈佛大學的Walter Gilbert和Charles
Weissmann在日內瓦成立。后來，Walter Gilbert和Phillip Allen Sharp先后榮獲諾貝爾化學獎和生理醫學獎。
雖然在這次COVID-19疫情期間Biogen公司以另一種方式被人們熟知，但依然不影響其作為神經科學的先驅者在基因治療領域的重要地位。
本文重點介紹并全文翻譯了Biogen公司的生物檢測和基因治療團隊于2019年發表于Molecular Therapy: Methods
& Clinical
Development的研究論文。研究者們為了提高日常病毒滴度檢測中蝕斑實驗的速度、通量、靈敏度以及穩定性，將熒光檢測方法與自動圖像計數相結合，并予以優化。文章以通俗清晰的筆觸描述了研究團隊開發和評估這一革新方法的全過程，并借此向廣大病毒學、基因治療和疫苗開發領域的相關工作者推薦。
綜合熒光檢測和基于圖像的自動計數方法提高蝕斑實驗的速度，靈敏度和可靠性
Abstract
蝕斑實驗（plaque
assays）用于測定病毒樣品的感染滴度。這些實驗通常需要很多天來完成且通量較低。同時，肉眼識別和手工計數蝕斑非常耗時和費力，并且結果很可能還會受人為偏見和主觀判斷的影響導致分析人員之間的差異。同時，該實驗必須為期數天，使蝕斑增長到足夠大的尺寸以便適合于人工鑒定。這里，為了提高蝕斑實驗的靈敏度和速度，我們整合了熒光檢測和自動蝕斑計數的方法。首先，我們用熒光標記的抗體對蝕斑進行染色；其次，我們采用了一種基于多孔板的細胞圖像分析儀，從而實現了無偏見、非主觀的自動蝕斑計數。這兩種技術的整合使得實驗時長縮短了40% （從原來的5天減少到了3天），這是因為蝕斑的大小、信噪比和肉眼可見度已不再是制約因素。這種優化了的蝕斑測定方法更加靈敏，快速、穩定，同時也更加拓展了測定蝕斑形成的應用和通量。
關鍵詞：蝕斑實驗，自動計數，熒光檢測，測定可靠性，基于圖像的計數，基因治療
Introduction
基因治療是一個在研究和臨床試驗中提供治療性基因的良好平臺。腺相關病毒（AAV）基于其有效性和良好的安全性，是將這些治療性基因導入至靶細胞的一種極有力的載體。AAV是一種非囊膜病毒，包括一條被蛋白質外殼包裹的基因組單鏈DNA（ssDNA）。AAV可以通過多種方法生產，包括瞬時轉染人胚腎（HEK）細胞，使用哺乳動物工程細胞株、桿狀病毒感染的昆蟲SF9細胞，或諸如單純皰疹病毒（HSV）等輔助病毒轉染的穩定細胞株。因為重組AAV（rAAV）載體是有復制缺陷的，所以它們需要包含輔助功能的質粒或輔助病毒（例如腺病毒或HSV）進行復制。
在感染過程中，當AAV進入細胞核時，ssDNA變成雙鏈（ds）的形式。該dsDNA是基因表達所必需的。如果沒有輔助病毒，AAV會以潛伏形式保留在細胞中。但是，當存在輔助病毒時，帶有目的基因的AAV就可被活化生產。由于最理想的rAAV的生產可以依賴于所用輔助病毒的濃度，因此輔助病毒的感染滴度是建立高效高產rAAV生產過程的關鍵因素之一。
腺病毒載體（adenovirus）不但是基因治療有力的工具，更是抗病毒疫苗開發的重要手段之一。腺病毒是一個正20面體形狀的病毒，將一段新冠病毒基因，如S抗原，傳遞進入該病毒后，20面體上會出現類似新冠病毒的刺突。腺病毒本身毒力很弱，因此可以利用它把新冠病毒的刺突抗原帶入體內激發免疫應答。近日，軍事醫學研究院生物工程研究所與天津康希諾生物股份公司聯合團隊合作的重組新冠疫苗就是利用這一原理開發的，并于上周率先獲批臨床，在武漢市開展I期試驗。合作雙方作為Cellometer胞計數儀多年用戶，Nexcelom公司深感使命光榮。小編獲悉，研究團隊已于武漢前方抗疫奮戰近兩個月，Cellometer胞計數儀也正用于疫苗臨床評價中的細胞免疫檢測環節。
有許多方法可以測定病毒基因組和感染顆粒的數量。病毒基因組滴度可通過RT-PCR，qPCR和Western
blot等技術對DNA或蛋白質進行實驗性測定而獲得；也可以利用衣殼蛋白滴度ELISA，流式細胞儀或市售病毒計數器對完整的病毒顆粒進行定量。最后，如HSV病毒，可以使用功能實驗方法對病毒進行定量，例如常規的蝕斑實驗（plaque
assay）或細胞病變效應（CPE）實驗。盡管蛋白質和顆粒計數器的檢測快速且定量，但它們無法提供有關病毒的傳染性或功能性的信息。
病毒滴度檢測是病毒學研究中最重要的步驟之一。病毒的滴度用來表示樣本中病毒的含量。病毒滴度的高低與活躍病毒的感染力（infectivity）強弱相關，因此也被用作臨床病毒感染中的治療監測。實驗中的病毒滴度通常測定病毒顆粒在特定細胞類型或動物中復制的能力。常用的檢測方式有蝕斑實驗（plaque
assay）、灶斑形成實驗（focus formation assay）和終點稀釋實驗（endpoint dilution assay）等。
細胞病變效應（cytopathic effect，
CPE）常被應用于鏡下可觀察到的病毒介導的（單層）細胞惡性變化。這些細胞形態改變包括細胞膨脹或收縮，細胞變圓、分散、聚團、裂解等，以及合胞體（syncytia）或胞內內涵物（inclusions）的形成。病毒感染導致的單層貼壁細胞裂解消失是最常見的CPE類型。若局部細胞可裂解形成肉眼可見的不連續的“空洞”，即為蝕斑。根據病毒類型的不同形成人眼可見的蝕斑通常需要3-14天。同時，宿主細胞、培養基的類型和pH都會影響形成蝕斑的大小和數量。