CyTOF：以單細胞的視角重新審視生命

　　【摘要】Fluidigm公司的CyTOF實驗系統，不但使原來復雜的工作流程得到了簡化，同時也將單細胞研究提升到了一個新的水平。基于此，Bendall和他 具有前瞻性思維的同事們已經獲得了諸多新發現。他們的研究對象是人的免疫系統，相對于成熟的免疫系統，其發育的動態過程更加的復雜，他們正在利用 CyTOF精細的揭示這一過程；這是CyTOF在新領域的應用。

　　很容易想象Sean Bendall博士被列入全美“40 Under 40”名錄（每年評選40個在各領域有突出表現的的年輕人）；他曾經在斯坦福Nolan實驗室任助理教授，這個實驗室位于美國Palo Alto小鎮，隸屬于加州蛋白質組研究中心的國家心肺和血液研究所（NHLBI）。Bendall不愧是一個年輕人的杰出代表，他的工作深深影響了其所從 事的研究領域。當今，一場新興的運動正在生物學界悄然興起，一系列單細胞生物學的技術不斷涌現，它們正在促使科學家以全新的視角重新審視一些傳統的研究領域。而Bendall則正走在這場運動的前沿。

圖一、Sean Bendall博士

　　Fluidigm公司的CyTOF實 驗系統，不但使原來復雜的工作流程得到了簡化，同時也將單細胞研究提升到了一個新的水平。基于此，Bendall和他具有前瞻性思維的同事們已經獲得了諸 多新發現。他們的研究對象是人的免疫系統，相對于成熟的免疫系統，其發育的動態過程更加的復雜，他們正在利用CyTOF精細的揭示這一過程；這是 CyTOF在新領域的應用，也為該領域提供了一個新的研究思路。

圖二、質譜流式實驗系統組成

　　在Nolan實驗室中任職期間，Bendall和他的同事們將蛋白磷酸化流式技術與質譜流式技術結合起來。該實驗室一直致力于流式細胞技術的改進和相關單細胞檢測方法的開發，目前已經成為該領域的領導者。

　　通過將蛋白質組學和高級數據分析方法有機結合，這個實驗室成功的對在正常和病變細胞信號通路進行了研究，這 種研究方法是革命性的。Bendall從他在Nolan實驗室的這段時間中獲取了很多靈感，并把這些靈感用于自己的新實驗室中。目前，兩個實驗室仍然密切 合作，并共享著他們的CyTOF系統。目前，Bendall的實驗室隸屬于斯坦福大學病理系，位于斯坦福血液中心，在這里他重點研究人類造血和免疫系統， 以及在健康或者病理（癌變，過敏和自身免疫性疾病）條件下的信號調控機制。

圖三、利用CyTOF對骨髓的信號通路分析（SPADE分析）

　　于此同時，NHLBI和斯坦福的跨學科合作也正在進行中，他們已經在肺動脈高壓（PAH）和自身免疫性疾病 等領域開展了四個研究項目。他們的合作正好順應了基因組學和蛋白質組學日益融合的大趨勢。Bendall解釋說，基因組數據具有很寬的覆蓋面，而單細胞蛋 白質組學的數據則是在單細胞水平上測量有限的參數。在Bendall本人的工作中，首先利用組學開啟廣闊的思路，再一步步縮小他的假設。“我不假裝自己是 一個單細胞分子生物學專家，”接著，他提起了一個在人過敏反應領域的合作伙伴Steve Galli，他可以算得上該領域思想領袖，現任斯坦福大學病理系主任，是研究過敏反應和過敏性免疫細胞功能方面的專家。

　　然而，Bendall是一個單細胞蛋白質組學和流式分析技術方面的專家。從理論上講，他可以在他的實驗室進行流式細胞分析，然后將樣本帶到校園另一邊，將它們放到另一個實驗室的檢測系統中進行檢測。所以，他有可能很快就可以溝通大學廣場兩邊的世界。

　　看到知識共享的光明前景，同時又擁有實現它的手段，這令一直熱愛技術的Bendall非常興奮。通過多年來 系統的科研訓練，他已經成為了一個研究蛋白的生物化學家。他本科的學習一開始專注于生物化學和微生物學領域，隨后逐漸轉到蛋白質化學、蛋白質組學和質譜領 域。后來，他曾在一個蛋白質組學實驗室工作，與另一個實驗室合作研究人類造血和胚胎干細胞。

　　研究中Bendall注意到，蛋白質組學可以分析上千萬個細胞的總體狀況；而干細胞研究則需了解單個細胞的功能；這似乎是一個悖論。

　　“當真正的根本問題在于單細胞的功能時，對大量細胞進行總體分析是很難奏效的。” Bendall回憶道。

　　這需要大量的后續工作，因為只有感興趣的細胞正好是大多數時，對于總體的分析才是有效的。正是這種“技術上的障礙”讓Bendall來到了斯坦福，他來尋找一種解決此類問題的工具——那就是基于單細胞檢測的質譜流式技術。

圖四、單細胞檢測的必要性：總體數據會掩蓋細胞多樣性

　　Bendall面臨的一大挑戰就是做人類的研究。在以人為研究對象時，所能動用的手段更加有限——因為做為 研究對象的人更不容易干預。“我們不可能弄一個籠子，把我們研究的人都養在里面。”Bendall笑道。我們可以敲除小鼠的一個基因，然后和了另一個帶有 該基因的小鼠進行對比。但是當研究對象是人類時，我們往往必須在沒有干預的系統中比較不同細胞。Bendall利用單細胞分析來消除這種復雜性。其目標是創建一套技術，闡明人體內藥物作用和基因功能。

圖五、人為研究對象的挑戰在于：其所能動用的技術手段更加有限

　　為了實現這一目標，Bendall正在重新設想其實驗策略，將單細胞分析應用于到相關的研究中。通常來講，在不同的平臺上檢測相同的樣本可以產生類似的數據，所以Bendall首先利用單細胞蛋白質組學分析樣本，然后使用另一個平臺進行更深入的研究。

　　“分化的干細胞——特別是在培養皿里時——是混雜著的一群細胞，”他說。逐個測量這些細胞有助于弄清群體存在的異質性，并將它們分門別類，這有助于Bendall將注意力集中于特定的細胞種類，防止實驗結果受到生物本身多態性的影響。

　　目前Bendall’s實驗室有幾個項目正在開展中，其中第一個是利用單細胞蛋白質組學研究人體過敏性粒細 胞群體。一方面，他正在觀察病人體內與常規過敏性反應相關的細胞。另一方面，他正在將基本生物學研究與人胚胎干細胞研究結合。胚胎干細胞可以進行基因操 作，因此可以借此研究不同調節蛋白的功能。

　　盡管科學界幾十年前就知道了這些類型的細胞，Bendall解釋說，“我們還沒有真正理解所謂‘異質性’的 正常水平是什么樣，以及在過敏性疾病病例中它們是怎樣變化的。”他的研究也有可能應用于斯坦福正在組織的過敏免疫治療臨床試驗中。簡單的 說，Bendall的研究重點是“理解正常我們就可以理解異常。”

　　有時，正常是一開始就被忽視的。當初Bendall來到諾蘭實驗室的時候，很多人在研究白血病。當他們研究癌變的骨髓樣本時，Bendall也在利用CyTOF研究急性髓系白血病。他的第一個問題是簡單明了：“健康的骨髓是什么樣子的？”但是實驗室并沒有健康的骨髓樣本，所以Bendall建議他們就從那里開始。因為病理學評分的基礎就是“它離正常有多遠”，對正常組織進行定量分析對于了解和預測組織異常至關重要。

　　圖六、利用CyTOF對正常人和AML病人骨髓的對比圖譜（分析方法：viSNE）

　　Bendall的第二個正在申請的項目，旨在探索單細胞技術如何應用于血液學研究。多年來對人類造血系統的 免疫學研究一直是研究的熱點，因為它與骨髓移植密切相關。在已有發現的基礎上，Bendall希望通過對比移植成功以及出問題的病例骨髓內發生的事件，來 了解骨髓植入綜合癥發生的精細機制。所以他打算利用單細胞技術對其機制進行精細分析。

　　“我們不要僅僅基于細胞表面Marker來厘清樣品的組成”Bendall說。“我們還可以利用胞內的起調 節作用的生化分子，正是它們影響了細胞的行為。”他的研究可能成為一項可行的臨床方法。例如，根據他的研究成果，如果一個人有太多的一種細胞類型而另一種 卻不夠，治療方案就可能按照該病人的情況進行精細的調整，實現個體化治療。

　　Bendall的工作還可能有助于重新定義科學家如何設計實驗。“傳統流式研究往往具有強烈的‘假設驅動’色彩，”他說。“它們往往是一些‘是或否’的問題，或者是一個清單。” 但是，當你不知道在尋找什么的時候該怎么辦呢？

　　在Bendall 2014年四月發表在Cell上的文章中，他在正常人骨髓中發現了B細胞前體的幾個新的組分，這在此前是沒有報道過的。一群被稱為“組分三”的B細胞，起 到了“看門人”的角色，決定了B細胞的成熟并做為一個“檢查站”防止自身免疫的發生。這是一個重大發現：

　　“這些細胞在骨髓中比率約為萬分之一，”Bendall解釋道，“所以，除非你清楚地知道細胞的特征是什么，否則你沒有辦法隨機的找到它們。”

　　圖七、2014年Bendall在《cell》中報道了一個新的B細胞前體亞群（Population 3）

　　CyTOF數據能幫助其找出正確的細胞群，這使Bendall能夠進一步進行基因組分析，以此證明B細胞的 基因組重排是隨著細胞發育過程而增加的。這不僅僅是一個發現——它成了一個全新的策略。它給了Bendall一個新的工作流程，這就是以這種分階段的方法 將基因組學和蛋白質組學結合起來，并在最后清晰的提煉出他的結論。

　　“在一個細胞群體中，也許1/3細胞的2/3是最有趣的，”Bendall提到。“我不知道怎樣區分這些細 胞，但現在我有一個基本的概念，我可以預先提純，使它們進入下一個實驗，在下面的步驟中可以采用諸如基因表達等其他指標更深入的挖掘細胞內的信息。這是不 同技術的結合，真正實現 “連續攻擊”。

　　首先，Bendall 利用CyTOF發現了一個新細胞群體，然后進行mRNA測序去尋找其獨特的表面Marker。根據這些表面Marker，就可以利用傳統流式富集特殊細胞群體。通過刺激物或藥物處理細胞，最后通過基因測序或質譜流式來深入研究其生物學效應。

圖八、新的研究策略：質譜流式與常規流式、DNA檢測等常規手段的有機結合

　　單細胞技術和CyTOF實驗系統都處于這種分階段研究策略的前沿，它使科學家們能夠“處理小數量的樣本同 時，可以提出許多許多問題，”他說。在某種程度上，Bendall和他的同事第一次走在一條返樸歸真的道路上。細胞是生命的基本單元，當你逐個去觀察它們 時，就可以明白更多。

　　鏈接：

　　Single-Cell Trajectory Detection Uncovers Progression and Regulatory Coordination in Human B Cell Development

　　http://s.oatos.com/f07358?locale=zh_CN